药用植物毛状根技术的研究

阐述了发根农杆菌的作用机理,对毛状根诱导过程中外植体、发根农杆菌种类、预培养及共培养时间、外源激素添加、酚类物质添加及培养条件等因素对诱导率的影响进行系统的论述,并对药用植物毛状根的鉴定方法及在次生代谢物的合成机制研究及生产、药用植物基因工程、新药物的产生、药物蛋白生产等方面的应用进行概述。     

冬凌草毛状根体系的建立

用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株对冬凌草无菌幼苗的叶片、茎段进行侵染,而后通过共培养的方法诱导其产生冬凌草毛状根,从而建立有效的冬凌草毛状根培养体系。通过PCR进一步检测T-DNA是否成功导入冬凌草毛状根中。通过用发根农杆菌ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株对冬凌草外植体进行侵染,能够成功诱导产生冬凌草毛状根,从而对冬凌草毛状根培养体系进行建立,在一定程度上为冬凌草毛状根的大规模培养奠定基础。     

乌拉尔甘草毛状根的诱导及培养体系的建立

采用针刺幼茎法和外植体共培养法,以发根农杆菌ATCC15834和A4侵染乌拉尔甘草子叶、下胚轴和活体幼苗,诱导毛状根生成,建立毛状根诱导及培养技术体系。试验结果表明,OD₆₀₀为0.5～0.6的ATCC15834菌液（含乙酰丁香酮100 μmol/L）经针刺幼茎法侵染株龄14 d的乌拉尔甘草活体幼苗后,在含500 mg/L头孢霉素的1/2MS培养基上毛状根诱导率达79.2%。毛状根在不含激素及蔗糖质量浓度为40.0 g/L的1/2MS液体培养基中生长迅速,25 d毛状根增殖率达到19.3倍。     

药用植物毛状根诱导及其培养技术研究

发根农杆菌介导的药用植物遗传转化现已广泛应用于植物次生代谢产物的生产。本文就发根农杆菌介导的药用植物遗传转化的机理、现状、转化方法及存在的问题作了简单的介绍。     

罗勒毛状根的诱导及培养

[目的]利用4种发根农杆菌R1,R1601,1025,1000诱导药用植物罗勒产生毛状根,建立毛状根培养体系。[方法]利用共培养法研究不同外植体、菌株、预培养时间、感染时间以及外源激素等对罗勒毛状根诱导率的影响。[结果]利用发根农杆菌1025,预培养2d的叶片为转化材料,感染6～8min,加入0.1mg/LNAA的诱导率最高。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察,确立罗勒毛状根在1/2MS培养基中的最佳继代时间为21d。[结论]罗勒毛状根离体培养的建立,为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

利用毛状根的培养生产植物次生代谢物

本文概述了毛状根（又称发状根）培养的特点及意义，毛状根诱导的分子机理，操作实例及毛状根的鉴定。     

农杆菌Ri诱导丹参毛状根培养体系的优化

采用发根农杆菌R1601菌株浸染丹参叶片、茎段、叶柄、带节茎段等外植体.结果表明,相比茎和叶柄,丹参叶片更适宜诱导毛状根;带节茎段经发根农杆菌R1601侵染后,幼苗根系较为发达,粗壮.而由其他3种丹参外植体诱导产生的毛状根生长相对较慢,形成的根较细而弱.     

南药巴戟天毛状根诱导条件优化研究

为探索巴戟天毛状根的诱导条件,该研究选择不同发根农杆菌ATCC15834、AR10、Msu440菌株诱导巴戟天无菌苗的幼芽、叶片、叶柄、茎段等外植体形成毛状根,并研究了共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对巴戟天毛状根转化率的影响。结果表明:巴戟天毛状根的最佳诱导条件为:以幼芽为外植体,ATCC15834为转化菌,侵染时间20 min,并在培养基中添加300μmol/L乙酰丁香酮条件下,巴戟天毛状根的诱导转化率最高,可达36.7%。     

发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立

选取中国大豆品种中黄13、黑豆44和黑豆51的子叶为外植体材料,用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)K599菌株诱导3个大豆品种产生毛状根,通过β-葡聚糖苷酶(GUS)染色进行转化效率检测。结果表明:在25℃、12h/d黑暗培养条件下,黑豆44上诱导的毛状根数量最多,显著多于中黄13和黑豆51;黑豆44诱导的毛状根转化率最高,显著高于中黄13,但与黑豆51没有显著差异;光照或黑暗培养对中黄13产生毛状根的效率没有显著影响,但黑豆44和黑豆51在黑暗培养条件下子叶产生的毛状根数明显高于光照培养条件下产生的毛状根数;大豆孢囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)能侵染3个大豆品种的毛状根,其中对黑豆51的侵染效率显著高于黑豆44和中黄13,侵染位点主要位于根系的生长点。     

苦荞麦毛状根的诱导研究

利用发根农杆菌Ri1601浸染苦荞植物预培养2d的叶片外植体,经不同时间的共培养和除菌培养后获得毛状根。经硅胶薄层色谱板检测表明,发根农杆菌Ri1601和苦荞叶片上未经转化产生的不定根都不含有冠瘿碱;而经发根农杆菌Ri1601遗传转化后所产生的毛状根有冠瘿碱的存在。因此,可确定苦荞叶片上产生的毛状根为发根农杆菌Ri1601转化所得。建立了用发根农杆菌Ri1601诱导苦荞植物叶片产生毛状根的有效方法。     

灯盏花发根培养条件筛选研究

为建立灯盏花的发根培养体系,用C58C1发根农杆菌空菌株和携带目的基因的菌株转化灯盏花叶片获得发根,测定发根的生长曲线,比较不同因素对发根生长量的影响。结果表明：利用发根农杆菌C58C1菌株成功从灯盏花中诱导出了发根,并建立了灯盏花发根最优的培养体系,其诱导的最佳农杆菌菌液浓度为OD600=06,最佳浸染时间为10min,最佳共培养时间为2d,在此条件下诱导率高达60%。经PCR鉴定证明Ri质粒的T DNA已成功转化灯盏花的发根。     

发根农杆菌侵染大豆产生发根的研究

利用A4发根农杆菌,对不同大豆品种的无菌苗采用针刺的方法对子叶节部位进行接种,诱导毛状根产生,测定毛状根中大豆苷元的含量。结果表明,以合丰35为受体材料,毛状根诱导率最高,为58%,明显高于其他处理。发根中大豆苷元的含量是正常无菌苗和大田幼苗根中含量的2倍。     

发根农杆菌诱导苦参毛状根的研究

[目的]为苦参有用成分的大量生产提供新的途径。[方法]利用发根农杆菌R1601分别对药用植物苦参的根段、茎段、叶片、子叶进行侵染。[结果]在相同条件下,叶片、茎段和根段成功诱导出毛状根,但诱导频率不同,茎段作为外植体诱导率最高,达到26.7%,更适合作为外植体选用。毛状根除菌后,能在MS培养基上自主生长。[结论]发根农杆菌的RiT-DNA基因已经整合到苦参基因组中。该研究为采用生物技术生产苦参活性成分奠定了基础。     

苦参毛状根诱导及其培养条件的研究

[目的]为药用成分苦参碱及氧化苦参碱的来源提供新途径。[方法]考察了R1601菌株对苦参不同外植体在不同浓度乙酰丁香酮和侵染时间影响下苦参毛状根的诱导率;研究了培养基中的组分和浓度对苦参毛状根继代生长的影响。[结果]以苦参幼芽为外植体,在R1601菌液中添加100μmol/L乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃,MS共培养基上暗培养2 d,苦参毛状根的诱导效果较好,诱导率28.6%,存活率46.7%;苦参毛状根在改良的继代培养基上生长良好。[结论]苦参毛状根的最佳诱导条件:以生长1周的苦参幼芽为外植体,R1601为菌株,添加100μmol/L的乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃暗处诱导。     

发根农杆菌菌株和烟草品种对毛状根诱导率的影响

采用3×3双因子设计,研究发根农杆菌菌株和烟草品种对烟草毛状根诱导率的影响。结果表明:各菌株在不同烟草品种上均诱导出毛状根,经PCR技术检测,确定了发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已整合到烟草基因组中。不同烟草品种和发根农杆菌菌株均显著影响毛状根的诱导率;Sumxun毛状根平均诱导率最高,达到了53.4%,其适宜菌株为A4和ATCC15834;K326为34.2%,其适宜菌株为R1000;云烟85为25.6%,其适宜菌株为ATCC15834。     

毛状根的研究进展及应用

作为一种天然遗传工程菌株,发根农杆菌可侵染160多种植物,使植物产生特殊的形态学变化并诱导植物产生大量的毛状根。由于毛状根可稳产高产的生成大量有重要价值的植物次生代谢物质,近几十年来毛状根系统的研究受到越来越多的关注。简要阐述了发根农杆菌诱导毛状根生成的机理,着重介绍了毛状根培育的研究进展及在生产植物次级代谢产物方面的应用。     

西洋参发根的诱导及其培养条件的研究

利用发根农杆菌A4菌株在西洋参根外植体上直接诱导产生发根。在1/2 MS和MS固体培养基上得到西洋参发根,并在B5液体培养基上建立起发根离体培养系,经连续多代的培养,发根仍保持旺盛生长状态。PCR扩增结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已整合到西洋参发根基因组中并得到表达。利用紫外分光光度法测得西洋参发根的总皂苷含量达3.88%。经对发根比生长速率的测定,确定1/2 B5培养基(15 g/L蔗糖)、摇床转速100 r/min、每4周更换1次培养基并继代培养1次为西洋参发根生长适宜条件。     

毛状根在药用植物次生代谢产物生产中的应用概况

毛状根应用于药用植物次生代谢产物的生产已有近30年的历史.对毛状根形成的影响因素、毛状根应用于次生代谢产物生产的最新进展进行了综述.     

微波辅助提取山豆根多糖工艺的优化

采用正交试验筛选山豆根多糖的最佳提取工艺.结果表明,山豆根多糖的最佳提取工艺为料液比1∶10(m/V,g∶mL),提取2次,提取时间90 min,此条件下山豆根多糖提取率为3.62％.该方法简便、准确、灵敏度高,适用于山豆根多糖的提取.     

桔梗发状根培养物的建立

本文用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的不同菌株,通过叶盘法对桔梗进行了感染试验。阐述了发根农杆菌诱导桔梗产生发状根的能力(简称诱导能力)及其影响因素;将发状根分离、除菌后,在不含激素的MS及其改良的培养基上培养,具有较高的增长速度。在发状根培养物中检测到甘露碱(Maenopine)和农杆碱(Agropine),证明发根农杆菌Ri质粒T—DNA已整合到桔梗核基因组中。