分子改良提高甘露聚糖酶的耐热性

以来源于嗜热放线菌（Thermobifida fusca）的甘露聚糖酶基因（KJ806638）为研究对象,利用易错PCR方法对其进行改造,获得了耐热性进一步提高的甘露聚糖酶。筛选获得的N16I突变株,其最适反应温度从72.5℃提升到77.5℃。差示扫描荧光定量（DSF）检测结果显示,酶蛋白质的表观解链温度Tm从61.9℃提升到63.2℃。     

一种来源于Paenibacillus sp. A1的中性β-甘露 聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究

采用简并PCR和TAIL-PCR技术,从来源于天山冰川土壤的类芽孢杆菌Paenibacillus sp. A1菌株基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列。序列分析表明,该基因全长960 bp,编码一个新的糖苷水解酶第5家族的β-甘露聚糖酶。将该基因克隆到原核表达载pET-22b(+)中,经过IPTG诱导表达,酶的胞外表达量达0.62 U/mL。酶学特性分析表明其最适pH为6.5,最适温度为55℃,属中性β-甘露聚糖酶,具有较好的底物适应性,适宜用于鱼类等水产动物养殖饲料行业中。     

β-甘露聚糖酶的研究进展

β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶类,是一种广谱诱导型多功能酶,广泛存在于动植物和微生物中,其主要水解产物为甘露寡糖,在动物生产、饲料、食品、医药、石油开采及生物技术方面广泛应用.对β-甘露聚糖酶的来源、生产、纯化、分子特性、作用机制以及微生物诱变育种等方面的研究概况进行了综述,并对β-甘露聚糖酶的应用前景进行了分析.     

微生物β-甘露聚糖酶的生产及应用

β-甘露聚糖酶可应用于造纸、饲料、洗涤、纺织、食品、医药和石油开采等工业领域,特别是在造纸和饲料工业中已得到了广泛的应用。从β-甘露聚糖酶的水解方式和产物、微生物的来源及其工业应用等方面做了简要介绍。     

β-甘露聚糖酶异源表达及甘露寡糖制备研究

以产β-甘露聚糖酶(MAN)的枯草芽孢杆菌HD145为目的菌株,PCR扩增MAN基因片段,克隆到p HBM905A载体并转化至毕赤酵母,重组子利用甲醇进行诱导。纯化的MAN酶解槐豆胶与瓜尔豆胶,质谱检测水解产物。SDS-PAGE结果表明,MAN基因实现了表达,摇瓶酶活性为3 200 U/m L,酶最适温度与pH分别为55℃与6.0,pH 4~7时稳定性较好,在40、50、60℃的半衰期分别为165、105、42 min,Zn~(2+)、Ag~+、Co~(2+)对酶活性存在一定的抑制。槐豆胶与瓜尔胶经MAN酶解后得到二糖至十糖的寡糖。     

甘露聚糖酶基因3'端缺失研究

[目的]初步研究甘露聚糖酶基因3’端对甘露聚糖酶功能的重要性。[方法]以甘露聚糖酶的二级结构为基础,用PCR扩增的方法获得3’端特异性缺失的甘露聚糖酶DNA片段,连接到载体上,表达并鉴定酶的活性。[结果]删除甘露聚糖酶基因3’端246bp后甘露聚糖酶依然具有酶活性。[结论]甘露聚糖酶基因3’端的部分序列不是酶具有功能所必需的。     

枯草芽孢杆菌MSJ-5产β-甘露聚糖酶的性质研究

对土壤中分离的1株产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌MSJ-5进行产酶性质的研究。菌株MSJ-5在发酵培养基中培养32h达到产酶高峰。β-甘露聚糖酶为粗酶液的主要组分,酶学性质的研究显示该酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.0,在pH 5.0~7.0能保持较好的稳定性。水解魔芋甘露聚糖及水解产物分析试验结果表明菌株MSJ-5产生的β-甘露聚糖酶对魔芋甘露聚糖有显著降粘效果,水解产物以甘露寡糖为主。研究结果显示,菌株MSJ-5产生的β-甘露聚糖酶有应用到饲料添加和功能性寡糖行业的潜力。     

Athelia rolfsii的β-甘露聚糖酶纯化研究

从发酵培养5d的产β-甘露聚糖酶的Athelia rolfsii菌株CBS191.62发酵液中经硫酸铵沉淀、琼脂糖凝胶(DEAE Sepharose Fast Flow)层析、羟基磷灰石(Hydroxylapatite)层析和冷冻干燥结晶等步骤, 获得了比活提高了15.1倍,分子量为14.7 kD的凝胶电泳均一的β-甘露聚糖酶蛋白样品.     

甘露聚糖酶产生菌F1-5的鉴定

[目的]鉴定1株高产甘露聚糖酶菌株。[方法]以高产甘露聚糖酶的菌株为对象,采用形态观察、生理生化试验及16S rDNA系统发育分析手段对其进行鉴定。[结果]该菌株在牛肉膏蛋白培养基上培养24h后,菌落表面粗糙,不透明白色,革兰氏阳性,杆状,能形成芽孢,表明其属于芽孢杆菌属。对F1-5进行生理生化特征鉴定,结果表明,其为枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌。PCR扩增获取该菌的16S rDNA基因。经BLAST同源序列比对,结果显示,菌株F1-516SrDNA与枯草芽孢杆菌的16S rDNA具有99％的同源性,表明F1-5为枯草芽孢杆菌。[结论]该研究为甘露聚糖酶工业化开发应用奠定了基础。     

黑曲霉β-甘露聚糖酶水解魔芋粉制备甘露低聚糖的研究

以魔芋粉为原料,研究了用黑曲霉β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的工艺条件.结果表明:反应时间、魔芋粉浓度、温度、加酶量、pH对酶法制备低聚甘露糖的工艺均有不同程度的影响,其中反应时间和温度影响较大,pH影响较小.通过正交试验确定了用黑曲霉β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的最佳工艺条件为:反应体系的pH4.2、魔芋粉浓度2.0%、温度65℃、加酶量108 U/g、反应时间为4.0 h.在最佳工艺条件下,低聚甘露糖的产率可达32.3%.     

嗜热氧化乙酸脱硫肠状菌的分离和特征

从一个在58℃连续运转多年的厌氧生物反应器中分离到一株硫酸盐还原细菌,定名为菌株CAMZ。菌株CAMZ细胞为1～1.5 μm×4～6.5μm,单个或成对,杆状,两端尖中间大,呈橄榄形。革兰氏染色阴性。能利用乳酸、丙酸、丁酸、丙酮酸、丙氨酸、H_2/CO_2、乙酸等多种基质,但不利用苯甲酸、软脂酸、葡萄糖、蔗糖,木糖、纤维二糖等物质。生长于H_2/CO_2时能合成大量的乙酸。菌株以SO_4~-,S_2O_3~-和S作为电子受体,并形成S~-,但不利用SO_3~-,NO_3~-,NO_2~-和甜菜碱作电子受体。需要维生素溶液或酵母浸提液促进生长。最适生长温度为55～60℃,最适pH为6.5～7.0。生长不需要NaCl,但可在低于1.5％NaCl培养基中生长。细胞具有很高的一氧化碳脱氢酶活性。DNA中mol％G+C为49.7。根据其形态和特征,认为菌株CAMZ是脱硫肠状菌属的一个新种,定名为嗜热氧化乙酸脱硫肠状菌(Desulfotomaculum thermoacetoxidans sp.nov.),典型菌株为CAMZ。     

禾本科植物内生真菌研究3:产生子座而无有性孢子的Neotyphodium属内生真菌-拂子茅属植物新共生体

2006年5月在南京市南郊发现了着生内生真菌子座的禾本科植物。子座长47.5~165.0mm,白色,包裹其宿主植物的旗叶叶鞘;于4月下旬形成,7月中旬完全崩溃;在自然条件下、人工交配试验中,子座上均未形成有性生殖结构。宿主植物直立,高90~120cm,有丰富的根状茎;连续2个花期均无抽穗。根据植物外部特征、叶表皮微形态特征以及rDNA-ITS序列的分析结果,将这种不抽穗的禾本科植物鉴定为拂子茅属植物(Calamagrostis sp.)。从29株着生子座的植株和87株不着生子座的植株中全部检出了内生真菌,从中分离得到了20个菌株。根据分生孢子、分生孢子梗的形态特征,分离菌株被鉴定为Neotyphodium属内生真菌。宿主植物的特殊性和菌株的子座形成能力显示了这是一个禾本科植物-内生真菌的新组合。这个组合是产生子座而不形成有性世代的第3例,并且这3例组合的宿主都是翦股颖族植物。     

内生细菌Bacillus sp.对菠菜枯萎病的防治效果研究

[目的]探讨内生细菌Bacillussp.对菠菜枯萎病的防病作用。[方法]就内生菌Bacillussp.对菠菜枯萎病菌平板抑制作用、不同浓度内生菌对菠菜枯萎病的防治效果及内生菌在菠菜根部的定殖位点进行研究。[结果]结果表明,浓度为1×107cfu/ml时,Bacillus sp.对菠菜枯萎病防治效果最好,且内生菌定殖在菠菜根部木质部导管中。[结论]从菠菜根部筛选出的内生细菌Bacillussp.对菠菜枯萎病有的较好防治效果,可以利用此开发具有潜在生防价值的生物制剂。     

糖醋液添加不同物质对粪蚊和菇蝇的诱杀效果试验

为探索糖醋液中添加蜂蜜、番石榴汁、芒果汁等对食用菌害虫粪蚊和菇蝇的诱杀效果,在按糖：醋：酒：水=5：6：3：10配制的糖醋液中加入占试液总量1%的30%敌百虫乳油,并分别加入占试液总量2%的蜂蜜、番石榴汁和芒果汁进行诱杀害虫效果试验。结果表明,在糖醋液中添加不同物质均能增强诱杀害虫的效果,其中以在糖醋液中添加蜂蜜对粪蚊和菇蝇的诱杀效果最好,可以在生产中推广应用。     

辣木内生真菌的分离及其抗菌活性物质的初步研究

从辣木中分离得到1株内生真菌ly14,其发酵液对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和掷孢酵母有很强的抗菌作用．该菌发酵液中的抗菌物质对温度、pH及紫外线照射有较强的稳定性;ly14代谢物的理化特性表明,抗菌物质为极性酸性化合物,其紫外可见吸收光谱在276nm处出现了一个较为明显的吸收峰．     

刺五加黑斑病病原生物学特性研究

研究了在不同温度、不同酸碱度和不同光照条件下刺五加黑斑病病原菌的生长速率和生物学特性。结果表明:5～35℃病原菌均可以生长,较适宜生长的温度为20～30℃,最适宜的生长温度为25～30℃;在pH2～12时病原菌均可以生长,pH 6时最适生长;不同光照条件对病原菌菌落生长也有一定的影响,其中,连续紫外灯照射的菌落生长势最好。     

高效聚磷鞘氨醇杆菌XF-5的分离与鉴定

采用寡营养与长时间培养方法,从活性污泥与土壤样品中分离筛选到7株高效聚磷菌。以菌株的除磷率为考察指标,确定其中的XF-5为高效聚磷菌株。对其培养条件进行优化,并进行了生理生化特性的检测与系统发育分析。16SrRNA基因序列的分析结果显示,XF-5与鞘氨醇杆菌属的菌种同源性达99%,结合生长特点与生理生化特性,初步确定该菌株为鞘氨醇杆菌(No-vosphingobiumsp.)。当合成废水中总磷质量浓度为10.0mg/L时,将菌株XF-5在28℃、pH值为6.5的条件下培养24h,除磷率可达80%以上。该菌株在污水除磷与水体富营养化的防治方面,有潜在的应用前景。     

紫海胆肠道放线菌Micromonospora sp．HDa2次生代谢产物的研究

采用常规色谱分离技术对分离自健康紫海胆肠道的稀有放线菌Micromonospora sp．HDa2发酵液的化学成分进行分离纯化,并以波谱技术确定化合物的结构。结果表明：从放线菌Micromonospora sp．HDa2的发酵液乙酸乙酯提取物中分离鉴定了6个已知结构的环二肽化合物．分别为环（苯丙-缬）二肽（1）、环（苯丙-亮）二肽（2）、环（苯丙-异亮）二肽（3）、环（苯丙-苯丙）二肽（4）、环（亮-亮）二肽（5）和环（亮-异亮）二肽（6）。对紫海胆肠道放线菌进行分离。结果发现以上化合物均是从Micromonospora属放线菌中发现的。     

组合芽孢杆菌抑菌物质特性及其抑菌效果研究

对组合拮抗芽孢杆菌Bacillus sp. CL-8抑菌物质的理化性质进行了研究。结果表明,主要抑菌物质为蛋白质类,热稳定性好,在40~70℃处理30 min后仍保持较高的抑菌活性;活性pH范围在4~10;能耐受乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、氯仿多种有机溶剂,且稳定性好;紫外线照射不影响其抑菌活性;对蛋白酶K作用不敏感;粗蛋白能有效抑制Fusarium oxysporumf. sp. lycopersici、Rhizoctonia solani Kuhn、Phytophthora capsici、Sclerotinia sclerotiorum、Acidovorax avenaesub sp. citrulli和Alternaria solani Sor-auer等病原菌;组合Bacillus sp. CL-8产生的挥发性物质对立枯丝核菌也有一定的抑制作用。     

一株深海细菌Idiomarina sp.406-6的微生物学特征分析

从印度洋海区水深为4 517 m的深海泥样中筛选到一株细菌,菌株号为406-6.通过形态学特征和生理生化特征分析表明,菌株406-6为革兰氏阴性菌,细胞呈稍微弯曲的棒状.菌落为乳白色,圆形.菌株406-6生长需要NaCl,62 ℃时生长微弱,能利用小分子的甘氨酸作为唯一碳源生长,但不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖、D-甘露醇、D-海藻糖和D-纤维二糖作为唯一碳源.能水解酪素、明胶、脱脂奶粉、Tween 40和Tween 60,但是不能水解淀粉、Tween 20和Tween 80.16S rRNA基因序列比对分析表明,菌株406-6与Idiomarina属的I.fontislapidosi F23T相似性最高(98.0%),和其他属的相似性均低于94.0%.Neighbor-joining系统树中,菌株406-6和Idiomarina属内的菌种相聚成簇.基于以上微生物学特征分析表明,406-6为Idiomarina属内的一个潜在的细菌新物种,该研究丰富了Idiomarina属的物种多样性,为微生物资源的开发利用奠定基础.