应用免疫转印技术分析副结核分枝杆菌胞浆蛋白的抗原性

应用免疫转印技术,着重对副结核菌P_(18)株胞浆蛋白抗原性进行了分析,并比较了不同菌株P_(18)、P_(10)Tcps、316F、2E、Ⅱ(国际标准株)、P_3、(吉林地方株)和8302(延边地区分离株)胞浆蛋白以及P_(18)、P_(10)株培养滤液中蛋白成份的抗原性;另外,对不同感染牛对副结核菌胞浆蛋白各组分的抗体应答反应性进行了比较。结果表明,P18株胞浆蛋白中的66.2～92.5、60.3、53.7、51.3、25.9～40.7、25.4和24.6Kd的蛋白质分子对S_6号副结核阳性血清发生反应,其中以24.6Kd蛋白质分子的抗原性最强。不同菌株的胞浆蛋白和培养滤液蛋白具有相同的抗原性。不同感染牛对副结核菌胞浆蛋白抗原各组分的抗体应答反应不同。     

副结核菌交叉反应性分析、特异性抗原的提取和抗血清的制备

通过用酶联免疫转印技术分析表明,副结核菌胞浆蛋白中24.6kd 蛋白抗系对副结核阳性血清有较强的反应性;对堪萨斯分枝杆菌、禽型结核菌和耻垢分枝杆菌抗血清有交叉反应;但对牛草分枝杆菌、偶发分枝杆菌和牛型结核菌的抗血清不发生交叉反应。用电泳制备技术提纯了24.6kd 蛋白带.并制备了对该蛋白的兔抗血清。     

副结核杆菌不同菌株菌体蛋白的高效液相层析分析

对副结核杆菌(M.Para)不同菌株菌体蛋白进行高效液相层析(HPLC)分析发现,它们都存在14个主要的特征峰,峰形基本一致,但含量差异很大,同序号峰间也有细微差异.M.Para 316F株只有10~+、14~+两个特异峰;2E、Ⅱ株特异地具有12~+峰;P_(10)、P_(13)株没有8~+峰.通过实验建立了副结核杆菌7株菌的HPLC图谱,为今后对副结核菌株的鉴定提供了一顶新指标,为同源性分析提供了一个新方法。     

结核分枝杆菌菌体蛋白、多肽的提取及其对鸡免疫功能的影响

以结核分枝杆菌为原料,提取菌体蛋白和多肽。用Lowry法检测菌体蛋白、多肽的含量,并对菌体蛋白、多肽进行Tricine-SDS-PAGE,分析其组分。将所提取的菌体蛋白和多肽分7组作用于鸡体,即菌体蛋白高、中、低剂量组,透析多肽组,未破碎全菌体组,菌体蛋白注射组和对照组,除注射组外,其余6组均采用口服给药。各组试验鸡于给药后7、14、21和28 d 4次屠宰,分别检测新城疫抗体滴度和外周血淋巴细胞转化率。结果表明:不同批次提取的菌体蛋白、多肽含量相对稳定,没有明显差异;组分分析表明,菌体蛋白由多种组分构成,分子量为6.5~66 ku;动物试验结果表明:结核分枝杆菌菌体蛋白试验组均能提高鸡体的细胞免疫和体液免疫功能,尤以菌体蛋白注射组和菌体蛋白中剂量口服组诱导机体免疫效果较好。     

企鹅源禽1型副黏病毒基因组序列分析

为了从分子水平上探讨企鹅源禽1型副黏病毒BP01的演化,根据GenBank登录的鹅源禽1型副黏病毒基因序列设计引物,运用RT-PCR方法于国内外首次测定了企鹅源禽1型副黏病毒全基因组序列,其全长为15 192nt.经分析表明BP01病毒基因组与SF02株和ZJ1株等鹅源禽1型副黏病毒同源性最高,分别为99.1%和99.0%;与IT-227/82和dove/Italy/2736/00等鸽源禽1型副黏病毒同源性分别为90.2%和88.1%;而与Hert/33和LaSota等鸡源禽1型副黏病毒的同源性最低,仅分别为87.9%/和83.2%.对F基因第47～435nt进行系统进化树分析和F基因第334～1 682 nt进行HinfⅠ、BstO Ⅰ、Rsa Ⅰ酶切位点分析,确定BP01株病毒为基因Ⅶ型.F蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合禽1型副黏病毒强毒株的特性,经预测发现BP01株病毒F蛋白的七肽重复序列分剐在第143～189位氨基酸残基和第461～503位氨基酸.通过对主要毒力基因推导的氨基酸序列进行比较发现,水禽源与其它源F蛋白有14个氨基酸不同,HN蛋白上有2个氨基酸的不同,而P蛋白有20个氨基酸的不同,且在第151～166位氨基酸存在一个明显的突变域.     

抗副结核分枝杆菌单克隆抗体的产生及其部分特性鉴定

通过BALB/C小鼠脾细胞和NS-I/1骨髓瘤细胞融合产生了6株抗副结核分枝杆菌单克隆抗体。用ELISA方法对其中4株与副结核分枝杆菌及其它7种分枝杆菌的反应性进行了初步研究。McAb PTB1只与副结核菌苗株Ⅱ、牛分枝杆菌及无色分枝杆菌有微弱的交叉反应。Mc Ab PTB2、McAb PTB3和McAb PTB4与试验过的7种分枝杆菌都有程度不一的反应。     

结核病牛多重耐药非结核性分枝杆菌的分离鉴定

为了调查分析目前牛群中结核病的实际感染状况,试验采用组织病理学筛查,菌株分离,16S rRNA、hsp65和rpoB三基因分析鉴定,抗结核常用药物的药敏测定等方法对某大型屠宰牛场屠宰牛的结核感染状况进行了研究。结果表明:从1 576头屠宰牛中筛选出11个疑似结核菌感染样本,经培养最终获得8株分枝杆菌分离株,分别命名为G46、F90、F20、FJ、Y28D、Y28P、5S、Y5,其中G46、F90、F20、FJ、Y28D、Y28P为偶发分枝杆菌,5S为鸟结核分枝杆菌,Y5为M.conceptionense并且M.conceptionense首次从牛中分离鉴定;16S rRNA鉴定所有菌株均为结核分枝杆菌属,hsp65和rpoB序列分析比对鉴定G46、F90、F20、FJ、Y28D、Y28P与偶发分枝杆菌的相似性为100%,5S和Y5与鸟结核分枝杆菌和M.conceptionense的相似性为100%;除菌株F20外,其余菌株表现出多重耐药性。说明目前牛群中结核病感染状况不容乐观,需要重视。     

马传贫病毒ELISA抗原有效成份分析及免疫学活性测定的研究

对21批马传贫病毒ELISA抗原样品,以SDS-PAGE进行组分分析及分子量测定表明,虽抗原批次不同,组分数亦不完全相同,但分子量范围却均在13600～110500道尔顿之间。通过酶联免疫电传移印渍技术(EITB)确定抗原的有效成份证明,有免疫学活性的蛋白主要是28600道尔顿组分,其次是13600道尔顿的组分。而马传贫病毒ELISA抗原免疫学活性与28600道尔顿组分的相对百分含量显著相关(P<0.01)。用特异的糖蛋白染色技术分析糖蛋白的组分表明,分子量为78000～8100及57000～5900道尔顿的两个组分呈阳性反应,但在EITB中没有表现出明显的免疫学活性。     

抗副结核分枝杆菌细胞壁抗原单克隆抗体的制备和特性鉴定

用3M 氯化钾浸出的副结核分技杆菌细胞壁抗原(KCl-Ag)免疫的 BALB/C 小鼠脾细胞和 NS-1骨髓瘤细胞融合,制备出3株抗副结核分枝杆菌单克隆抗体—McAb-JM_1、JM_2、JM_3。用 ELISA 方法对3株单克隆抗体与副结核分枝杆菌及其他6种分枝杆菌不同抗原的反应性进行了研究.McAb-JM_1与副结核分枝杆菌不同菌株间的 KCl-Ag 和部分胞浆抗原(PPD)发生交叉反应;在其他分枝杆菌抗原中,仅与牛草分枝杆菌的 PPA 和禽型结核分枝杆菌 KCl-Ag 发生交叉反应.McAb-JM_2在副结核分枝杆菌中.与强毒株抗原发生较强反应.而与弱毒株抗原反应性较弱。McAb-JM_3在分枝杆菌中.除 Teps 株和偶发分枝杆菌抗原外.均发生交叉反应。本文讨论了这些单克隆抗体在副结核病血清学诊断及抗原分析中的意义和用途。     

牛白血病病毒成分分析及生物活性的研究 Ⅰ.牛白血病病毒琼脂免疫扩散抗原的质量评价

对12批琼扩抗原,以紫外吸收法测定总蛋白台量;以SDS-PAGE技术(以SDS-7为标)结合Cs-930凝胶扫描测定每批样品的蛋白组分数、各组分的分子量和相对百分含量;以琼扩试验测定抗原效价。结果,总蛋白含量在30.76～85.8mg/ml之间;有11～20种组分,主要是分子量为15、24、28、34～38、51～53、58～60、64、70、96Kd和大于100Kd的10种组分;糖蛋白主要成分是53Kd;抗原滴度,P抗原为1:16～32,gP抗原为1:4～32。抗原活性火小与P~(24)和gP~(51)含量有关。冻干,对P抗原无影响,可使gP~(51)含量降低。与美国抗原对比分析证明,我所制造的琼扩抗原在产品质量上有的接近,有的超过。     

多头绦虫抗原特性的研究──多头绦虫节片抗原及原头节ES抗原的SDS-PAGE分析

为了探明多头绦虫成虫节片抗原及多头蚴原头节排泄分泌（ES）抗原的多肽组分，以供今后在免疫诊断与预防脑多头蚴病的应用，本试验应用SDS-PAGE首次分析了多头绦虫成虫节片抗原及多头蚴原头节ES抗原的多肽组分。应用12．5％凝胶的连续系统，垂直板型电泳，考马斯亮兰R－250染色的结果表明，成虫节片抗原共有16条多肽带，其分子量范围29～154kD，其中主带4条，分别为73、88、128、134kD，原头节ES抗原共6条多肽带，分子量范围33～132kD，其中主带2条，分别为33和108kD。本试验初步阐明多头绦虫成虫节片抗原和原头节ES抗原的多肽组分，为进一步研究多头绦虫抗原的特性奠定了基础。     

牛副结核病的病理学研究——人工感染病牛的病理学变化

我们为了筛选牛副结核菌强毒菌株,从不同疫区、不同品种副结核病牛群中,选择具有副结核病的典型临床症状及明显病理形态学变化的牛,做菌体分离,把分离到的野菌,对33头健康犊牛进行了致病性的人工接种、病理学观察和细菌学培养的试验。现将其病理学变化报道如下。     

新城疫病毒贵州分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒（NDV）F基因序列设计了一对引物,用RT-PCR方法扩增了8个NDV贵州分离株的F基因片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1662bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.0%～99.7%和87.5%～99.3%,但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的氨基酸同源性为87.2%～97.7%。F蛋白裂解位点的氨基酸序列分别为112R-R-Q-R/K-R-F^117（其中P1、H2、N98、DQ、FW、BY、GZ7株为强毒）和112G-R-Q-G-R-L^117（TN1株为弱毒）。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明,4个分离株（P1、H2、、N98、DQ）为基因Ⅶ型,2株（GZ、TN）为基因Ⅱ型,2株（FW、BY）为基因Ⅸ型。     

胞内分枝杆菌及偶发分枝杆菌对小鼠巨噬细胞凋亡的影响

为了研究非结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡的影响,采用胞内分枝杆菌和偶发分枝杆菌分别感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,流式细胞术检测细胞凋亡率,ELISA法检测TNF-α及IL-10的表达,检测这2株菌在小鼠巨噬细胞中的增殖。结果显示:胞内分枝杆菌引起的细胞凋亡水平低于偶发分枝杆菌组(P0.05),这2株菌所引起的TNF-α的表达量在4 h、12 h较高,与空白对照组相比差异显著(P0.05),在24 h、48 h下降明显,而IL-10的表达整个感染过程都比较高。并且还观察到胞内分枝杆菌的吞噬率较高(P0.05);增殖能力较强(P0.01)。表明菌体毒力与凋亡率、细胞因子的表达、增殖率有着直接关系。     

鸡新城疫融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

根据NDVNL株的F基因序列，自行设计带有XbaⅠ和XhoⅠ酶切位点的一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增含NDVF基因的PFL质粒,扩增结果与设计相符，大小为630bp。该片段覆盖F基因的2/3的抗原决定簇。对该片段两端酶切后，克隆到融合表达载体pThioHisB中，并转化到大肠杆菌Top10内，利用AMP抗性筛选阳性重组子，并用PCR及双酶切鉴定克隆成功，用IPTG化学诱导表达了F基因。经SDS－PAGE电泳分析，结果在分子量约为35KD处可见到表达的蛋白条带。这与根据核苷酸大小计算的蛋白及融合蛋白之和的大小相符。说明外源片段插入正确表达成功。用HRP标记的兔抗鸡抗体与该条带进行Western－Blot检测，该条带呈阳性反应。进一步证实表达正确。通过蛋白灰度扫描显示表达的融合蛋白占菌体总蛋白的20％。     

鸽Ⅰ型副粘病毒ZQ98-1株F基因全序列的克隆和序列分析

本研究报道了PMV－1／鸽／肇庆／1／1998株（ZQ98－1）F基因的全序列。该基因核苷酸序列长度为1712bp,编码由553个氨基酸组成的F0多肽。F0蛋白裂解位点处的氨基酸序列为^112K-R-Q-K-R-F^117,F0蛋白中有3个与病毒副合相关的重要抗原位点和6个糖基化位点。经比较,鸽Ⅰ型副粘病毒ZQ98－1株和PMV－1／Pigeon/England/1168/84(1168/84)株、Warwick株及Ulster株核苷酸序列的同源性分别为95％、90％和89％,氨基酸的为异率分别为5．4％、6．2％及9．1％。     

免疫鸭体内副黏病毒的分离及其F基因的分子特征

为分析当地鸭副黏病毒流行状况及其融合蛋白(F)基因的序列特征,从江苏省某新城疫疫苗免疫过的鸭群中分离到1株病毒,经血清学试验和中和试验鉴定为鸭副黏病毒,命名为JS0920株.生物学特性分析,9日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5.3；9日龄SPF鸡胚的最小致死量平均死亡时间(MDT)为47.7h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.875,6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定为2.7.用该病毒的培养物(鸡胚尿囊液)经肌肉注射攻毒,鸭的发病率为70％,死亡率为40％；鸡的发病率和死亡率均为100％.用RT-PCR方法扩增该分离毒株的F基因,序列分析表明,JS0920株与标准强毒株F48E9的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高,分别为99.2％和99.5％,与免疫预防用的LaSota株的同源性分别为89.0％和92.2％；其多肽裂解位点为112R-R-Q-R-R-F117,具有高致病性鸭副黏病毒毒株的分子特征；系统发育进化树分析,JS0920株与LaSota株的基因型不同,JS0920株为基因Ⅸ型,与F48E9株的亲缘关系最近.试验结果对认识当前DPMV的流行和变异现状以及疫苗研制具有重要的参考价值.     

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。     

牛白血病病毒反转录酶的纯化及结构的研究

将FLK/BLV培养上清经差速和梯度离心提纯的牛白血病病毒(BLV).经NP-40裂解后.分别采用Poly(A)·oligo(dT)_(12_18_)纤维素.Poly(G)-DEAE-纤维素和Poly(G)-磷酸纤维素等亲和层析法纯化了BLV反转录酶(RT)及前体.酶活性回收率分别为16.6％、3.34％和38.6％。经Cs-930凝胶扫描分析,酶制剂中RT的相对百分含量分别为53.9％、67.5％.实验表明,Poly(G)-磷酸纤维素层析是提纯BLV-RT的有效方法;用DEAE-纤维素和肝素-琼脂糖层析法不能提纯BLV-RT.提纯的酶制剂经SDS-PAGE分析,测得RT分子量为69.6kd(P69.6).发现了酶的前体蛋白.其分子量为95kd(P95)同时还发现有一条分子置为15kd(P15)的多肽区带,推测为BLV该酸内切酶结构的一部分。     

多株猪源大肠杆菌结构抗原和分泌抗原的研究

选取6株(300、303、316、325、327和343)猪源大肠杆菌免疫家兔制备高免血清,与6株菌的全菌抗原、菌体(O)抗原、渗透因子及外膜蛋白抗原分别进行交叉凝集试验和琼脂扩散试验。结果表明,大肠杆菌的主要抗原为O抗原,其中300和303 2株菌的抗体与其他4株菌的抗原具有广泛的交叉性。