表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5HA-EGFP.采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5HA-EGFP).经目的基因PCR检测及序列测定,结果表明:HA基因已经正确地插入到腺病毒的基因组中;通过RT-PCR检测与Western blot分析,结果表明:HA基因能够进行正确转录,并且所表达的蛋白具有相应的生物学活性.子代重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP经增殖、纯化后感染性滴度可达2.26×1010 TCID50 mL-1.rAd-H5HA-EGFP免疫BALB/c小鼠能够诱导特异性的HI抗体产生,有效阻止病毒在体内的复制.     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致。基因序列分析表明:第5、10、15代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1mL。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析.结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B.再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1.经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21（DE3）（pLysS）感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白.用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性.     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NA基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对3株H5N1亚型高致病性禽流感病毒新疆株的NA基因进行了扩增,分别得到了3个毒株的NA基因,序列分析表明,3个毒株NA的全长核苷酸序列均为1 380 bp.同源性分析表明,3个分离株之间的核苷酸同源性在95.1%～97.9%之间;与来自青海、浙江、广东、东南亚等不同地区水禽禽流感病毒毒株的同源性为90.3%～98.8%;与分离自香港、浙江、越南等地区的流感病毒同源性为86.7%～97.9%.     

H5亚型禽流感病毒核蛋白基因重组质粒的构建及其在Hela细胞的瞬时表达

采用PCR技术从重组质粒pMel-NP扩增得到了禽流感病毒（AIV）A／GOOse／Guangdong／1／96（HSN1）株的核蛋白（NP）基因，将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX—NP阳性克隆转染Hela细胞，48h后经间接免疫荧光试验和Western—blotting检测，NP基因在Hela细胞中已成功瞬时表达。表达产物的分子质量约为57ku，它与H5N1亚型AIV多克隆抗血清有较好的免疫反应。     

H5N1亚型禽流感病毒NP基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒NP基因序列设计、合成PCR克隆引物。自H5N1阳性病料中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶,经PCR扩增NP基因,采用Invitrogen定向表达系统进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NP蛋白,分子质量约66.0ku。采用单克隆抗体和阳性血清经ELISA、免疫印迹分析重组蛋白的免疫反应性。结果表明:所获得的重组NP蛋白在ELISA分析中均能与阳性血清和单克隆抗体发生特异性结合,但在免疫印迹分析中仅与阳性血清发生特异性结合。     

表达虎源H_5N_1亚型禽流感病毒NP蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

将A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)的NP基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有NP基因的表达盒(CMV+NP+PolyA)克隆入pVAXE3的SspⅠ酶切缺失处,获得含有NP基因表达盒的穿梭载体pVAXΔE3-NP。用SalⅠ+NruⅠ分别对pVAXΔE3-NP和pPoly-2-CAV-2进行双酶切,将含有NP基因表达盒的片段定向克隆入pPoly-2-CAV-2,获得在E3区缺失处插入NP基因表达盒的重组质粒pCAV-2-NP。释放CAV-2-NP重组基因组,脂质体介导转染DK细胞,获得了能使DK细胞产生典型腺病毒样细胞病变的CAV-2-NP重组病毒。从形态学、基因组水平、NP基因的转录、NP蛋白的表达以及重组病毒的生长特征等方面进行鉴定。结果表明,CAV-2-NP具有典型的CAV-2形态特征,在繁殖过程中没有对H5N1NP表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录H5N1NP基因的mRNA,ELISA和免疫荧光分析表明重组表达产物可被流感病毒NP基因单克隆抗体1G6G4所识别。     

H5N1亚型禽流感病毒HA部分基因的克隆与可溶性表达

本研究根据Genbank中记录的禽流感H5N1亚型HA基因序列,设计了一对特异性引物,提取禽流感H5N1亚型病毒RNA,并利用一步法RT-PCR方法扩增HA部分基因,与pMD18-T载体连接克隆扩增并鉴定后提取质粒与32a质粒同时分别双酶切并进行连接克隆扩增,提取重组质粒后转入E.coli Rosetta细胞中进行原核表达,通过检测证明得到了可溶性表达,大小约为35kD左右。从而为进一步试验和研究打下了坚实的基础。     

H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用

为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,通过优化RT-PCR反应条件和反应体系,建立了H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法。同时,运用H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明,本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性,所扩增的目的基因片段大小分别为428 bp和678 bp左右,可检出最小基因组RNA浓度为2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒,其余样品中均未检出H1N1亚型猪流感病毒,两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测,可在H1N1亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。     

禽流感病毒KMI/99(H9N2)HA和NA基因的序列分析

研究分别以自行设计的一对简并引物和另一对普通引物，经RT－CR，一次性成功地扩增禽流感病毒A／Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2）HA全和基因cDNA和NA全长基因cDNA，并将它们克隆于pGEM-T Easy的T－T窗口，首次报道了该毒株的HA全基因和NA全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列，测序结果显示，该毒株的HA基因全长为1683bp，编码560个氨基酸。NA全长为1398bp，编码466个氨基酸残基。研究发现其HAI羧基端的分子特征是：R－S－S－R。从分子水平推论。A/Chicken/Guangxi/KMI/99(H9N2)属于非高致病力毒株。研究还发现NA蛋白于63－65位缺失了T、E、I三个氨基酸。     

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因的克隆及其重组禽痘病毒转移载体的构建

采用RT－PCR技术扩增了禽流感病毒A／Guangdong/3/96(H5N1)[GD3/96]神经氨酸酶（NA）基因，并将其克隆到pUC18质粒中进行测序。核苷酸序列测定结果为：NA基因全长为1410bp，共编码469个氨基酸，从pUCNA中切下NA基因片段，将其亚克隆到质粒pSY538的EcoR I位点，将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的Sma I位点，然后切下同位含有NA及LacZ基因的片段，再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的Not I位点，经限制性内切酶分析，PCR鉴定等，证明含有禽流感病毒NA基因的重组禽痘病毒转移载体已构建成功，从而为进一步筛选表达NA蛋白的重组禽痘病毒及探讨该蛋白的免疫原性鉴定了实验基础。     

共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

Construction and Immunogenicity of a Recombinant Adenovirus Expressing the HA Gene of H5N1 Subtype Swine Influenza Virus

<正>To construct a recombinant adenovirus shuttle plasmid pDC315-H5HA-EGFP,the HA gene of A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1) was amplified by RT-PCR and then inserted into adenovirus shuttle plasmid pDC315.A replication-defective recombinant adenovirus expressing the HA gene(rAd-H5HA-EGFP) was generated by co-transfecting the recombinant shuttle plasmid pDC315-H5HA-EGFP and the genomic plasmid pBHGlox△E1,E3Cre in HEK293 cells.The recombinant adenovirus was confirmed by PCR,RT-PCR and Western blot assay.These results demonstrated that HA protein was properly expressed by the rAd-H5HA-EGFP in HEK293 cells and had natural biological activities.The TCID_(50) of the rAd-H5HA- EGFP was assessed to be 2.26×10~(10)/mL after propagation and purification.Immunization of BALB/ c mice indicated that rAd-H5HA-EGFP induced HI antibodies and protected mice from replication of the challenge virus in their lungs.     

表达H5N1亚型禽流感HA-NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建

将禽流感病毒H5N1亚型具有免疫原性的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,克隆于表达质粒Tmd-CMV-IRES-EGFP中,使其位于含细胞巨化病毒(CMV)早期启动子的调控下,并与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联,将上述串联基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)基因的非必需区(US10)中,从而构建了带标记的重组转移质粒。将该转移载体质粒感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF),利用脂质体共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,利用蚀斑筛选带有绿色荧光的重组病毒蚀斑,数轮蚀斑纯化,经荧光和PCR初步鉴定获得了重组火鸡疱疹病毒。     

H5N1亚型禽流感基质蛋白M1基因的原核表达和纯化

为获得纯度大于90%的M1蛋白,构建重组质粒PET-22b-M1,将正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测分析表达形式和表达量,并经Ni2+柱亲和层析与柱层析纯化表达蛋白。结果表明:试验成功构建了pET-22b-M1表达载体;IPTG诱导后高效表达出分子质量约为28 ku的M1融合蛋白;纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,且获得的M1蛋白纯度达95.4%。     

H5N1亚型AIV NS1基因在大肠杆菌中的表达

根据已测得的H5N1亚型禽流感病毒的NS基因序列,设计并合成一对特异性引物NS1U/NS1L,利用RT-PCR方法扩增出该毒株的NS1基因。将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a( )上,通过酶切分析及序列测定,鉴定出了NS1基因片段的阳性重组子。转化BL21大肠杆菌感受态细胞后,经IPTG诱导和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,成功表达出大小约45.0kD的NS1融合蛋白,表达产物主要存在于包涵体中。用West-ern-Blotting证实重组融合蛋白可以特异性地被标准阳性血清所识别。     

反向遗传操作技术产生全禽源致弱的H5N1亚型禽流感病毒的免疫保护性试验

利用反向遗传操作技术产生致弱的8基因全禽源的H5N1亚型禽流感病毒rgF-H5△N1，经甲醛灭活制成油苗免疫SPF鸡和有母源抗体的商品鸡。比较拯救的重配病毒rgF-H5△N1和野毒H5N1亚型禽流感病毒油苗免疫后的抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标，评价其免疫和交叉免疫保护作用。结果表明：反向遗传操作技术为构建新型的流感疫苗株提供了更好的方法。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。