猪细小病毒NS1非结构蛋白和VP2结构蛋白主要抗原区间接ELISA方法的建立与联合应用

为了建立猪细小病毒野毒抗体的NS1-i ELISA和猪群PPV免疫抗体水平的VP2-i ELISA方法,试验采用猪细小病毒NS1和VP2基因主要抗原区纯化后的原核表达重组蛋白作为包被抗原。结果表明:检测灵敏度为1∶12 800;批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,NS1-i ELISA方法与HI试验的符合率为100%;VP2-i ELISA方法与HI试验的符合率为94.7%,且比HI试验具有更高的敏感性。用这两种方法同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)和猪O型口蹄疫病毒(FMDV)6种常见猪病病毒的阳性血清结果均为阴性。说明所建立的NS1-i ELISA和VP2-i ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性。这两种方法可联合应于PPV野毒感染的快速诊断、流行病学调查、猪群免疫疫苗后PPV抗体水平的检测以及猪群PPV的净化。     

无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001(登录号:NC_018646)目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD_(50)为5.68×10~4 CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。     

宁夏中部半干旱带不同灌溉量下的禾豆混播效果

以紫花苜蓿(Medicago sativa)和沙打旺(Astragalus adsurgens)两种豆科牧草与无芒雀麦(Bromus inermis)、披碱草(Elymus dahuricus)、扁穗冰草(Agropyron cristatum)3种禾本科牧草为材料,在宁夏中部半干旱地区开展禾本科和豆科牧草单播及禾豆混播试验,设置3种水分梯度处理,即低灌溉量(484 mm)、中灌溉量(707 mm)、高灌溉量(1 160mm),对不同水分处理条件下单混播组合的产量、整株的碳同位素分辨率(Δ~(13)C)及光合作用参数等生理指标进行测定分析。结果表明,在宁夏中部干旱带有灌溉条件下进行禾豆牧草混播可以提高群体的产量和水分利用效率,其中沙打旺+披碱草混播组合产量及水分利用效率表现最好且Δ~(13)C值最高。不同水分处理对禾、豆牧草的株高、光合生理参数、产量及Δ~(13)C等有显著影响(P0.05)。牧草混播组合在高灌溉量时的产量、水分利用效率(WUE)及Δ~(13)C最高,低灌溉量条件下最低。在高灌溉量时Δ~(13)C、气孔导度(Gs)、叶温、株高等与产量和WUE的关系最为密切。因此,在高灌溉量时可将高Δ~(13)C作为筛选高产组合的标准,在低灌溉量时可将低Δ~(13)C作为筛选抗旱节水组合的理想指标。     

减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344株asd平衡致死系统的构建及其特性

为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。     

无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001（登录号：NC_018646）目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD₅₀为5.68×10⁴ CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。     

羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株铁应答调控因子irr和rirA基因缺失株的构建与鉴定

为研究铁调控因子irr和rirA在羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)感染过程中的作用,本研究通过卡那替换的方法构建两个缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA,分别将亲本株和缺失株在相同营养条件下培养36 h,观察其振荡培养时的生长变化趋势。分别将1×10~8 CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90接种到含1.5 mol/L NaCl、pH 2.5、pH 11.5、10 mmol/L H_2O_2的1 mL布鲁氏菌液体培养基,比较缺失株和亲本株在不同条件下的生长特性;分别以1×10~6 CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90感染小鼠巨噬细胞RAW264.7检测缺失株的黏附、侵袭和胞内生存能力。结果显示,在相同体外培养条件下缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA生长速度明显低于亲本株;M5-90Δirr、M5-90ΔrirA在高盐、强酸和强碱环境下生存率均显著或极显著低于亲本株(P0.05;P0.01),在H_2O_2条件下这两个缺失株的生存率却显著高于亲本株(P0.05)。与亲本株相比,缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7内的侵袭和黏附能力均减弱,在感染后45 min缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA的黏附和侵袭能力均极显著低于亲本株(P0.01),但在感染后24 h,这两个缺失株在细胞内繁殖能力与亲本株相比有所增强。本研究报道了irr和rirA基因不仅调控了羊种布鲁氏菌的生长,同时对细菌黏附和侵袭能力也产生一定的影响,M5-90Δirr和M5-90ΔrirA是两株具有潜力的布鲁氏菌候选疫苗株。     

内化素A/B对单增李斯特菌在模拟酸性胃环境中耐受性的影响

单核细胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes,LM)是一种重要的食源性病原菌,它可以通过人口途径进入胃肠道,并穿越屏障进入肠道细胞中定殖并感染,由此可见该菌引起食物中毒的首要条件是抵抗人体内恶劣的酸性胃环境。本研究以单增李斯特菌LM90SB2及内化素基因缺失株LM90SB2ΔInlAB、LM90SB2ΔInlA、LM90SB2ΔInlB为受试菌,对4株菌进行生长曲线的测定,对其携带毒力基因溶血素(hly)扩增验证;不同pH条件下的生长曲线测定,以及模拟酸性胃环境中的耐受性研究。结果表明2～6 h 4株菌处于对数生长期,并均携带溶血素O的毒力基因hly,适宜生长的pH为6～7,pH=9时LM90SB2生长显著高于LM90SB2ΔInlAB(P0.05)。受试菌在模拟胃环境中的存活率与其pH及作用时间相关,当pH=3.5时,4株菌的存活率依次为LM90SB2LM90SB2ΔInlA LM90SB2ΔInlBLM90SB2ΔInlAB;当pH=2.5时LM90SB2生长极显著高于LM90SB2ΔInlAB(P0.01),且随着时间的推移,4株菌生长曲线均呈下降趋势;当pH=1.5时,LM90SB2在l h、2 h时分别有0.075%及0.03%的存活率,而缺失株的存活率为0。研究表明,内化素A/B在LM抵抗人体酸性胃环境中发挥重要作用。     

重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)在雏鸡体内主要组织器官定植情况检测

为检测重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)在雏鸡体内主要组织器官定植情况,本研究将120只1日龄雏鸡随机分成3组,分别用减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13、重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)和PBS免疫,在免疫后4、24、48、72、96、120、144及168h,分别检测减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13和重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)在雏鸡心脏、肝脏、脾脏、盲肠和血液的定植情况。结果显示,在免疫后24h减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13在血液中数量达到了一个峰值,24~48h血液细菌数量下降,48~96h血液中细菌数上升并在96h达到另一个峰值,96~168h血液中细菌数量下降,在心脏、肝脏、脾脏、盲肠这几个脏器中,细菌的数量分别在4~72h呈上升趋势并在72h达到峰值,72~96h脏器细菌数量下降,96~120h菌数上升并在120h达到峰值,随后细菌数量下降;免疫重组减毒沙门氏菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)组在雏鸡各脏器细菌总数变化及定植情况与ΔcrpC79-13相似。结果表明,重组菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)与亲本菌株ΔcrpC79-13均可在雏鸡心脏、肝脏、脾脏、盲肠等器官定植,且在各脏器中菌株定植变化趋势一致但数量下降。     

降水量和生长方式对红砂和珍珠根系形态特征的影响研究

为揭示典型荒漠植物地下根系对降水变化和种间关系的响应,本研究以红砂(Reaumuria soongorica)和珍珠(Salsola passerina)为材料,通过人工模拟降水变化,测定不同降水量(年降水量50 mm～300 mm,Δ=50)下单生和混生红砂和珍珠的根系形态特征指标.结果表明:随着降水量的增加,单生、...     

猪流行性腹泻活疫苗（PEDV SHBS-ΔORF3株）对非靶动物的安全性试验

为了检验猪流行性腹泻活疫苗（PEDV SHBS-ΔORF3株）对非靶动物的安全性,用批次为201901、201902、201903疫苗分别接种小鼠和豚鼠,观察动物是否发生局部或全身不良反应。结果表明,接种小鼠和豚鼠均未出现不良反应,用猪流行性腹泻活疫苗（PEDV SHBS-ΔORF3株）接种非靶动物小鼠和豚鼠是安全的。     

布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株铁应答调控因子irr和rirA基因缺失株的构建与鉴定

为研究铁调控因子irr和rirA在羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）感染过程中的作用,本研究通过卡那替换的方法构建两个缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA,分别将亲本株和缺失株在相同营养条件下培养36 h,观察其振荡培养时的生长变化趋势。分别将1×10⁸ CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90接种到含1.5 mol/L NaCl、pH 2.5、pH 11.5、10 mmol/L H₂O₂的1 mL布鲁氏菌液体培养基,比较缺失株和亲本株在不同条件下的生长特性;分别以1×10⁶ CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90感染小鼠巨噬细胞RAW264.7检测缺失株的黏附、侵袭和胞内生存能力。结果显示,在相同体外培养条件下缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA生长速度明显低于亲本株;M5-90Δirr、M5-90ΔrirA在高盐、强酸和强碱环境下生存率均显著或极显著低于亲本株（P<0.05;P<0.01）,在H₂O₂条件下这两个缺失株的生存率却显著高于亲本株（P<0.05）。与亲本株相比,缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7内的侵袭和黏附能力均减弱,在感染后45 min缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA的黏附和侵袭能力均极显著低于亲本株（P<0.01）,但在感染后24 h,这两个缺失株在细胞内繁殖能力与亲本株相比有所增强。本研究报道了irr和rirA基因不仅调控了羊种布鲁氏菌的生长,同时对细菌黏附和侵袭能力也产生一定的影响,M5-90Δirr和M5-90ΔrirA是两株具有潜力的布鲁氏菌候选疫苗株。     

鸭疫里默氏杆菌AS87＿05150基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为探究鸭疫里默氏杆菌(RA) IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87＿05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150,经PCR及测序鉴定,结果显示AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150和回补株cYb2Δ5150均正确构建,缺失株的表型为16S r RNA⁺AS87＿05150 ORF^-,回补株的表型为16S r RNA⁺AS87＿05150 ORF⁺。采用荧光定量PCR (qPCR)检测Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株AS87＿05150基因的转录水平;根据上述3株菌不同时间的OD_600nm值绘制各菌株的生长曲线;采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力;将10⁷ cfu/孔的Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株分别感染Vero细胞,检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。q PCR检测结果显示,cYb2Δ5...     

弓形虫全抗原免疫对雏鸡生长与器官发育的影响

为研究弓形虫ΔKu80株全抗原免疫对雏鸡生长和器官发育的影响,试验选用7日龄的罗曼蛋鸡公母各40只,分为8组,每组10只,分别皮下注射不同剂量的弓形虫ΔKu80株全抗原,每日观察各组鸡只的临床症状,记录体重变化,并在免疫后第28天进行剖检,采集各器官进行器官指数分析。结果表明:各组公鸡和母鸡的体重变化趋势一致,除公鸡组肝脏指数有差异外,其他各组各器官指数差异不显著(P0.05)。试验所用的弓形虫ΔKu80株全抗原疫苗对雏鸡的生长和重要器官的发育无不良影响,以1×10~6个/只弓形虫ΔKu80株全抗原疫苗的剂量免疫雏鸡,能够促进公鸡的肝脏发育和母鸡生长。     

鸭疫里默氏杆菌对鸭胚肝细胞粘附入侵能力的研究

为了分析鸭胚肝细胞用于鸭疫里默氏杆菌粘附入侵实验的可行性,本研究比较了鸭疫里默氏杆菌对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附和入侵能力。首先将构建的互补质粒pRES1-ompA通过双亲本接合转导的方法导入ompA基因缺失株Th4ΔompA中,构建得到缺失株的回复菌株cTh4ΔompA;然后比较了野生株Th4、缺失株Th4ΔompA及回复株cTh4ΔompA菌株对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附入侵能力。结果表明,与野生株Th4菌株相比,缺失株Th4ΔompA对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附能力分别降低了3.32倍和3.12倍,入侵能力分别降低了2.25倍和7.58倍,而cTh4ΔompA对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附入侵能力均得到部分回复。本研究结果表明鸭胚肝细胞可用于鸭疫里默氏杆菌粘附入侵能力的分析。     

肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因缺失株的毒力相关功能研究

为研究肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因在肠炎沙门菌感染中的毒力作用,利用Red同源重组系统对2株肠炎沙门菌(国内标准株50336和国际参考株SD-2)SPI-19的Hcp基因进行敲除,成功构建了50336ΔHcp和SD-2ΔHcp基因缺失株,并构建了回补株50336ΔHcp/pHcp和SD-2ΔHcp/pHcp。分析比较缺失株与野生株对人肠上皮细胞系Caco-2黏附和侵袭能力,以及在鸡巨噬细胞HD11的存活能力。结果显示:缺失Hcp基因后,肠炎沙门菌50336对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降39.1%和47.9%;SD-2对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降46.5%和58.9%。吞噬作用2h后,50336ΔHcp和SD-2ΔHcp与野生株相比在HD11的存活量下降了35.7%和37.2%,差异显著。通过Real Time-PCR试验分析,与野生株相比,Hcp基因缺失后fliC、sefA、ompA,ompC这4个重要粘附因子编码基因的表达量显著下降。试验表明,肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因对肠炎沙门菌的毒力具有增强作用。     

PRV FB株gE/gI基因缺失株的构建及其灭活疫苗免疫保护效力评价

自2011年以来,新型伪狂犬病病毒(PRV)变异株在我国免疫猪场不断出现,导致目前商品化疫苗免疫效果不佳。为研究PRV FB株gE/gI基因缺失株疫苗防控新型PRV变异株感染的效果,本研究以PRV自然弱毒FB株作为亲本株,通过同源重组的方法构建了PRV g E/gI基因缺失株,将不同代次PRV FBΔgE/gI株与亲本PRV FB株分别接种BHK-21细胞,观察CPE和测定TCID50效价,分析缺失株的遗传稳定性,结果显示FBΔgE/gI株感染BHK-21细胞后产生与亲本株FB相似的CPE,且不同代FBΔgE/gI株的TCID50与亲本株相比均无明显变化。将FB株、FBΔgE/gI株、Bartha-K61株分别接种健康新西兰兔,比较三者的安全性,结果显示,接种BarthaK61株的家兔全部死亡(5/5),接种FB株的家兔死亡2只(2/5),而接种FBΔgE/gI株的家兔全部(5/5)健活,表明FBΔgE/gI株对新西兰兔的致病力较低,安全性更高。将FBΔgE/gI株分别与水相佐剂GEL02和两性佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊28 d后,采用ELISA法检测各组绵羊的gB和gE抗体,并且以PRV变异株FJ-2012攻毒,评估FBΔgE/gI株灭活疫苗对绵羊的保护效力,结果显示,接种GEL02和ISA 206为佐剂的FBΔgE/gI灭活疫苗绵羊在免疫后28 d,抗体均全部转阳;对照组绵羊在攻毒后6 d内全部死亡(5/5),以GEL02作为佐剂的灭活疫苗组绵羊死亡2只(2/5),而以ISA 206为佐剂的绵羊全部存活(5/5),保护率达到100%,表明以ISA 206作为佐剂的FBΔgE/gI株灭活疫苗能够完全保护绵羊抵御PRV变异株的攻击。本研究首次基于PRV自然弱毒FB株构建的FBΔgE/gI株,与Bartha-K61株相比具有更高的安全性,与佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊后能够完全抵抗新发变异PRV的攻击,具有完全保护作用。本研究为我国新发变异PRV疫苗的研发提供了新的参考依据。     

表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌的构建及其生物学特性分析

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。     

一种用于Red同源重组的正反筛选表达盒的构建及其反向筛选性能分析

为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法,本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因(str~S,即rpsL基因)和卡那抗性基因(kan~R),采用重叠延伸PCR方法将str~S基因和kan~R基因拼接,并将拼接片段分别克隆于pMD18-T和pBAD33载体中,再以重组载体为模板,以带有flgK基因同源臂的引物扩增获得Placstr~S-kan~R打靶片段和Parastr~S-kan~R打靶片段,然后结合Red重组技术构建了相应的flgK基因敲除菌株placSK-ΔflgK/TOP10和paraSK-ΔflgK/TOP10,并通过链霉素最小抑菌浓度(MIC)试验检测两种筛选系统的反向筛选性能。结果显示,野生型TOP10菌株、placSK-ΔflgK/TOP10菌株和paraSK-ΔflgK/TOP10菌株的链霉素MIC值分别为8 000μg/mL、2 000μg/mL和500μg/mL。表明采用两种筛选系统构建的敲除菌株均有一定的链霉素敏感表型,具有反向筛选的能力,但含Para启动子的筛选系统反向筛选性能更好。本研究建立了可用于大肠杆菌Red重组技术的反向筛选系统,为获得更有效的Red重组筛选工具提供了依据。     

新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鸡白痢沙门菌口服活疫苗载体。本研究以pcDNA3.1-Zeo(+)质粒为基础,用沙门菌asd基因替代其氨苄抗性基因Amp,构建不含抗性基因的真核互补质粒pcD-asd;再将互补质粒pcD-asd电转入沙门菌ΔcrpΔasdC79-13,构建ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因EGFP克隆入pcD-asd,构建重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd-EGFP),感染鸡胚成纤维(CEF)细胞,Western blot分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株ΔcrpΔasdC79-13及野生株C79-13保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢,对氨苄抗生素敏感;重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)的LD50较野生株C79-13降低了3.4×104倍;Western blot结果发现,重组菌株感染CEF细胞后,可表达大小约为27 000EGFP蛋白。以上结果证实,本研究成功构建了新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)株,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。