应用TaqMan探针进行马铃薯金线虫实时荧光PCR检测技术研究

马铃薯孢囊线虫是全球性的植物检疫性线虫,亦是我国重点关注的有害生物。针对马铃薯金线虫ITS序列,设计了引物和TaqMan 探针,使用15个马铃薯孢囊线虫群体和4个其他孢囊线虫样品进行验证,可高度灵敏地检测单个马铃薯金线虫的孢囊或幼虫,并可进行定量;最高检测灵敏度达到10fg;同时开展了混合样品和未知样品的检测,证明了引物的专化性和TaqMan探针的特异性。该检测方法可自动化检测马铃薯金线虫并进行定量,适合进行标准化的常规检测。     

木质包装中松材线虫的实时荧光PCR检测

松材线虫是进境木质包装中的重要检疫对象之一。本研究以进境木质包装中截获的12种伞滑刃属线虫,包括4种不同来源的松材线虫、3种不同来源的拟松材线虫、豆伞滑刃线虫、大尖尾伞滑刃线虫、阿苏里伞滑刃线虫、伯氏伞滑刃线虫及拟小刺伞滑刃线虫为材料,进行实时荧光PCR检测。结果显示,仅松材线虫可观察到明显的荧光强度变化,而其他线虫的荧光强度没有变化。通过研磨样品的方法,提取单条松材线虫的DNA,进行实时荧光PCR试验,检测成功率为100%,且不论是雄虫、雌虫或幼虫均能检测出来。该研究对于我国口岸进境木质包装中松材线虫的检测具有一定的实际意义。     

鳞球茎茎线虫实时荧光PCR检测技术的研究

传统的线虫形态学鉴定存在经验性强和幼虫难以鉴定等不足.本文根据线虫ITS基因序列多态性,设计鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)特异的TaqMan探针,建立了实时荧光PCR检测方法.对茎线虫属的鉴定实验表明:只有鳞球茎茎线虫产生特异性荧光信号,同属的其他线虫均检测到荧光信号.整个检测过程只需30min到2h,能够满足口岸检验检疫快速通关的要求.     

半巢式反转录实时荧光PCR检测马铃薯黑环斑病毒

本研究根据基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式反转录实时荧光PCR检测PBRSV的新方法.该方法采用E.Z.N.A TM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式反转录实时荧光PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达300fg/μL植物总RNA.     

实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

采用实时荧光PCR技术建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的检测方法。根据瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,设计了该病菌特异性引物和TaqMan探针,并对所设计的引物和探针的反应条件进行了优化。采用本试验建立的实时荧光PCR方法对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,可将瓜炭疽病菌与其他病原菌区分开。灵敏度试验表明,25μL体系中只要有39.6pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到1.584pg/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。同时对田间采集的病株和未知样品进行的检测证明了引物和TaqMan探针的特异性。     

实时荧光PCR快速检测苹果蠹蛾

苹果蠹蛾(Cydia pomonella L.)是重要的国际检疫性害虫。本文根据苹果蠹蛾线粒体COI基因序列设计引物和探针,对苹果蠹蛾及其相似种进行实时荧光PCR检测,结果表明,不同虫态的苹果蠹蛾均能够与近似种类区分开来。该技术可快速准确地鉴定苹果蠹蛾,为检疫性害虫苹果蠹蛾的检疫提供了一种新的方法。     

土壤中南方根结线虫的实时荧光PCR检测和定量

为了准确测定土壤中南方根结线虫Meloidogyne incognita的群体密度,根据序列特异性扩增区标记设计了南方根结线虫特异性引物和TaqMan探针,分别建立了卵和2龄幼虫的实时荧光PCR定量检测体系,并将该检测体系与显微镜计数法进行了比较.结果表明,引物Mi-F/R及探针Mi-probe对南方根结线虫具有高度特异性,建立的标准曲线循环阈值与卵和2龄幼虫数量的对数值之间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.9771和0.9853,扩增效率均为90％,检测灵敏度为10-1个卵及10-3条2龄幼虫;对10个田间土壤样本的检测显示,实时荧光PCR定量检测与显微镜计数法测定的南方根结线虫卵和2龄幼虫数量呈显著正相关,且两种方法对2龄幼虫的测定结果无显著差异.     

丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测

 为了快速、准确地检测丁香疫霉病菌 (Phytophthora syringae, PSY),根据GeneBank中PSY的ITS序列设计特异引物Psy1/Psy2和探针P-Psy,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物Psy1/Psy2扩增供试的26株PSY能得到585 bp的预期目标条带,但扩增其它61个非PSY供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为12 pg菌丝DNA;探针P-Psy对供试26株PSY表现为阳性扩增,而对其它菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达120 fg菌丝DNA,比常规PCR高100倍;引物Psy1/Psy2和探针P-Psy对5 g土壤中PSY卵孢子的检测灵敏度分别为20 000个和200个。样品检测试验表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确和特异地检测丁香疫霉病菌。     

香蕉穿孔线虫双重PCR快速检测技术研究

 香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)是国际上公认的植物检疫性有害生物之-, 是热带地区果树上最重要的线虫。通过设计的属水平上的特异性引物R1、R2(R1/2)和种水平上的特异性引物RS1、RS2(RS1/2)进行双重PCR扩增香蕉穿孔线虫, 可扩增出长度为362和291 bp的2个特异性片段谱带。同时分别对检测体系中反应参数进行优化, 最佳延伸温度为51.4℃, 引物R1/2与RS1/2最佳浓度配比为0.2μmol·L^-1/1.2μmol·L^-1, 并测试检测引物的灵敏度, 能进行有效检测的最低起始核酸量为100 pg;同时, 也能对单条线虫进行检测以及样品中线虫的检测。专化性测试证明, 2对引物能有效地进行香蕉穿孔线虫的快速分子诊断。     

冬生疫霉的实时荧光PCR检测方法

冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)是我国检疫性病原菌。本研究根据冬生疫霉的ITS基因序列,设计了实时荧光PCR引物PH-F和PH-R及TaqMan-MGB探针PH-Pr,建立了冬生疫霉的实时荧光PCR检测方法,可检测到冬生疫霉DNA最低浓度为50 fg/μL,而冬生疫霉的近似种、近缘种和空白对照,无荧光信号增加。因此,利用该方法可以稳定、高效的检测出冬生疫霉。     

警惕检疫性有害生物马铃薯孢囊线虫(Globodera rostochiensis和G. pallida)入侵我国

马铃薯孢囊线虫包括马铃薯金线虫Globodera rostochiensis和马铃薯白线虫G. pallida, 是马铃薯生产上危害最为严重的植物寄生线虫, 一般造成30%的产量损失, 在热带发病严重地区, 产量损失高达80%~90%, 甚至绝收?由于其危害严重性, 包括我国在内的100多个国家将其列为重要检疫性有害生物?我国目前尚无马铃薯金线虫和白线虫的发生报道, 但随着贸易全球化, 马铃薯孢囊线虫传入我国的风险日趋增高?本文主要对马铃薯孢囊线虫的发生分布?危害症状?经济损失?生物学特性?传入我国的潜在风险和预防控制措施进行综述, 旨在为防止马铃薯孢囊线虫入侵我国提供参考?     

Increased virulence of Globodera pallida during repeated rearing on different resistant potato cultivars explained by a simple model

Selection for virulence of Globodera pallida on potato cultivars was studied for four generations under controlled conditions. The reproduction rate (P_f/P_i) of a mixed Pa2/3 population increased by a factor of 61 during rearing on the partially resistant potato cv. Darwina compared to rearing on the susceptible cv. Irene. This was a result of selection for virulence on cv. Darwina, and achieving the Hardy–Weinberg equilibrium on cv. Irene. Increased virulence also significantly raised the reproduction rate on several other Solanum genotypes. These changes could be explained reasonably well by the monogenic inheritance of a virulence factor breaking the Grp1 locus. The virulence changes were probably mainly evoked by this gene only, inherited from S. vernei 1-3 or S. vernei 24/20. The Grp1 locus has probably provided the differential S. vernei hybrid (VTⁿ)² 62-33-3 with its resistance to the Pa2 group and not to the Pa3 group. Alternation of cultivars did not halt selection if the cultivars highly differentiated between the Pa2 and Pa3 populations. Only when alternation was with cultivars that harboured a different resistance gene against Pa3 was selection for virulence delayed. Differences in virulence levels (i.e. reproduction rates) within the nematode population determined the rate of selection, not the resistance level itself. Selection of a Pa3 population for three generations on cv. Karakter not only increased the reproduction rate on cv. Karakter itself by a factor 4.2, but also raised the reproduction on other potato genotypes. A simple monogenic model could explain these changes in virulence.     

马铃薯金线虫的分子检测技术

本研究通过利用随机引物OPK-4对马铃薯金线虫和白线虫及甜菜胞囊线虫进行RAPD-PCR,供试马铃薯金线中5个群体能产生630bp的特异性的片段,将特异性片段进行测序后发现5个不同来源的马铃薯金线虫产生的特异性片段序列完全一致。根据测定的DNA序列设计出特异性探针,可有效地用于马铃薯金线虫的分子检测。     

基于TaqMan MGB探针的花生矮化病毒检测研究

花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)是我国进境检疫性有害生物。本研究根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了PSV的实时荧光RT-PCR检测方法。方法特异性研究表明,针对PSV的2个不同株系PSV-E和PSV-W,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为20.10和21.22;而对于黄瓜花叶病毒、番茄不孕病毒、马铃薯Y病毒、菜豆荚斑驳病毒以及烟草环斑病毒等其他毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高100倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对PSV的检测。     

LNA探针实时荧光定量PCR检测小麦矮缩病毒体系的建立

 本研究通过对多个小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus, WDV)小麦分离物进行序列分析,在编码Rep蛋白N 端的基因保守区域设计一对特异性引物和一条长度为19 bp的TaqMan LNA探针,经过探针和引物浓度的系列优化,建立了WDV田间样品LNA探针实时荧光定量PCR检测方法,确定最优反应条件下的引物和探针终浓度分别为0.5 μmol/L和0.3 μmol/L。该方法建立的标准曲线斜率及相关系数分别为-3.424 3和0.997 3,扩增效率为96.0%,重复性试验组内变异系数为0.11%~1.34%,组间变异系数为0.44%~1.21%,最低检测限为55 copies/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍以上。与普通TaqMan探针荧光定量PCR相比,该方法所用探针长度大大缩短,减少了探针间形成二级结构的机会,探针设计更加简单、方便。该方法适用于田间样品的早期监测,为病害流行调查提供了高效快捷的技术支撑。     

苜蓿萎蔫病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

苜蓿萎蔫病菌是我国对外检疫性二类有害生物，目前国内尚无发生6在出入境捡验检疫中主要是采用生物学和血清学方法进行检测，劳动强度大，耗费时间长。根据苜蓿萎蔫病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计出对苜蓿萎蔫病菌具有稳定点突交特异性探针，利用该探针对棒形杆菌属4个种及其它属细菌进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有苜蓿萎蔫病菌能检测到荧光信号，其它细菌没有荧光产生。该方法特异性强，灵敏度高，能检测到21．4fg质粒DNA，比常规PCR灵敏100倍，而且整个过程只需要2～3h。该方法可有效地应用于进出境病原菌检测之中。     

实时荧光定量PCR在植物病害流行学中的应用

实时荧光定量PCR广泛应用于植物病理学研究的各个领域。近年来已开始应用于植物病害流行学的定量研究中,本文对近年来实时荧光定量PCR技术在病菌初始菌源的定量分析、病害流行动态的监测、寄主抗病性的快速鉴定和植物病原菌的抗药性监测等方面的应用进行了综述。