粗糙脉孢菌GH45家族内切纤维素酶基因ncGH45在毕赤酵母中表达及重组酶的性质表征

纤维素酶作为一种重要的糖苷水解酶,在生物质能源生产、饲料、造纸、洗涤和纺织领域都有着非常广泛的应用。粗糙脉孢菌来源的GH45家族内切纤维素酶基因(nc GH45)全长935 bp,包含一个53 bp的内含子(339-391),编码272个氨基酸,包括一个N-端的GH45家族催化结构域和C-端的1家族碳水化合物结合结构域。该基因在毕赤酵母中得到了分泌表达,且表达蛋白条带单一,酶活性达到20 U/m L。重组酶r Nc GH45的最适p H为4.5~5.0,最适温度为60~65℃,并且在较宽的p H范围(p H 4.0~8.0)和温度范围(30~70℃)都能维持75%以上的酶活。在37℃和50℃,p H 3.0~11.0都有着非常好的稳定性;该酶的热稳定性非常好,在70℃和80℃处理2 h还能剩余89.6%和77.7%的酶活,即使在沸水中煮10 min还能剩余10%的酶活。r Nc GH45的最适底物是地衣多糖(1 116.0 U/mg),其次是大麦葡聚糖(754.2 U/mg)和CMC-Na(254.6 U/mg),对大麦葡聚糖和CMC-Na的动力学常数Km和Vmax分别为6.26 mg/m L和997.4μmol/mg·min,19.96 mg/m L和722.1μmol/mg·min。水解产物分析结果表明,r Nc GH45对多糖的水解产物主要是纤维五糖,对寡糖的最小作用底物是纤维三糖,而对纤维二糖没有作用。对纺织品脱毛实验的结果表明,酶的添加量为10 U时,减量率为1.55%。上述结果表明成功构建了r Nc GH45高效表达工程菌株,表达的重组蛋白性质优越,有着良好的工业应用前景。     

嗜热革节孢第十二家族内切葡聚糖酶的定点突变

纤维素酶有广泛的应用前景,探究纤维素酶的性质及其催化作用机制有重要意义。本研究对嗜热革节孢第十二家族内切葡聚糖酶steg1基因进行定点突变,研究突变对酶活性的影响。选择位于酶催化活性通道上的6个氨基酸位点(N35、W37、Y77、W128、Y145、N168)进行突变,得到8个突变酶(N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145F、Y145A、Y145W、N168Q)。结果显示,与野生酶WT相比,所有突变酶的活性降低,其中突变酶Y77F、W128S、Y145A的Km值和kcat值都降低;N35Q的Km和kcat值都升高;W37H、Y145F、Y145W、N168Q的Km值升高,kcat值降低。WT与突变酶的最适p H值为5.0,均保持不变。突变酶Y77F、N35Q的最适温度降低到50℃,WT和其余突变酶的最适温度为55℃。突变酶Y77F和N35Q在60℃处理10 min后分别保持49.34%和22.90%的活性,WT和其余突变酶在60℃处理10 min后都失活。本研究为探究内切葡聚糖酶的催化作用机理以及分子改造奠定基础。     

近暗散白蚁 β-葡萄糖苷酶RpBgl7的异源表达及酶学性质研究

为研究近暗散白蚁(Reticulitermes perilucifugus)β-葡萄糖苷酶RpBgl7,利用生物信息学分析β-葡萄糖苷酶RpBgl7的家族及结构特点,构建RpBgl7的重组表达载体pCold-TF-RpBgl7,在大肠杆菌中过量表达并纯化,分析其最适反应条件和酶动力学参数。结果表明,RpBgl7属于糖苷水解酶1家族,具有2个保守的谷氨酸催化残基Glu187和Glu394。RpBgl7在BL21(DE3)中过量表达,经过镍离子亲和层析1步纯化可得到高纯度RpBgl7重组蛋白。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,测得RpBgl7的最适pH值为6.0,最适温度为70℃;动力学参数K_m=0.13 mmol/L,k_(cat)=3.15 s~(-1)。RpBgl7可耐受Na~+、K~+、Mg~(2+)、Cu~(2+)和Ba~(2+),而Ca~(2+)、Hg~(2+)和Fe~(3+)明显抑制RpBgl7的酶活力。     

白腐真菌粗酶液对印染废水的脱色研究

利用黄孢原毛平革菌培养5 d后所得的培养液,高速离心后得到木质素过氧化酶的粗酶液。研究粗酶液对偶氮染料活性翠蓝KGL的脱色能力,得出最佳脱色条件为在最适浓度100μmol/L过氧化氢存在的情况下,粗酶液对活性翠蓝KGL脱色的最适pH值为4.5,最适温度为37℃。     

嗜热纤维素分解菌TH3-9固体发酵产纤维素酶条件初步研究

[目的]探讨嗜热侧孢霉TH3-9突变株固体发酵产纤维素酶的最佳条件。[方法]采用单因和正交试验对嗜热侧孢霉TH3-9突变株固体发酵产纤维素酶条件进行研究,并测定CMC酶和滤纸酶(FPA)活力。[结果]单因子试验表明,该突变株产CMC酶和FPA酶的最适条件是:碳源为麸皮+甘蔗渣,氮源为(NH4)2SO4,培养温度45℃,培养时间3 d,起始pH值5.5,含水量60%。正交试验表明,最适产酶培养基为:麸皮+甘蔗渣(1∶2)40 g,(NH4)2SO41.0 g,K2HPO40.1 g,MgSO4.7H2O 0.03 g,含水量60%,pH值5.5;在45℃下培养3 d后测得的CMC酶和FPA酶活力最高,分别达832.56和70.38 IU。[结论]该突变株在高温下能利用廉价天然纤维素类物质生产纤维素酶。     

镰刀菌 Q7-31T 菌株植物细胞壁降解酶系的结构

为探究植物细胞壁降解酶高效降解细胞壁的机制,用 RT-PCR 方法对 Q7-31T 菌株植物细胞壁降解酶基因片段进行克隆,使用 Prot-Param、SOPMA、ProtScale Server 等软件对质谱鉴定结果进行生物学分析。结果表明：将 Q7-31T 菌株植物细胞壁降解相关酶归为 GH5家族内切葡聚糖酶、GH7家族内切葡聚糖酶、GH7家族外切葡聚糖酶和 GH10家族内切木聚糖酶4类酶。这些相关酶类为中等分子量大小,二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲4种元件构成,其中无规则卷曲的数量最高;均为亲水性酶,磷酸化位点比例较高,存在1～2个糖基化位点;均存在较高比例的催化结构域,三级结构呈中空的 C 字形。结论：少量的糖基化位点、高比例的催化结构域、多变的三维构象、大量的磷酸化位点与高效的协同作用方式可能决定 Q7-31T 菌株的植物细胞壁降解酶对细胞壁的高效降解。     

R262K点突变将紫穗槐二烯合酶变为(3R)-(E)-nerolidol合酶

倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合物打下基础。本研究利用定点突变技术,对紫穗槐二烯合酶RxR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E)-nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。由于RxR基序在倍半萜合酶家族中非常保守,因此其作用是否具有普遍性值得进一步验证。     

麻疯树种子β-1,3葡聚糖酶的优化提取及其部分性质分析

用NaCl浓度、pH值和 (NH4)2SO4饱和度三因子优化麻疯树种子中β-1,3葡聚糖酶粗酶的提取条件.结果表明,麻疯树种子在pH 7.0的条件下用含1 mol*L-1 NaCl的5 mmol*L-1磷酸缓冲液和用60 %～80 %饱和度的(NH4)2SO4沉淀后提取得到的β-1,3葡聚糖粗酶总酶活和经纯化的β-1,3葡聚糖酶总酶活均高于所试其它条件,也高于前人的研究约2倍.纯化的β-1,3葡聚糖酶经酶学性质和稳定性测定,其最适作用温度为 40～50 ℃,最适pH为7;在30～55 ℃以及pH 6～8 范围内最稳定.理化性质分析表明,该酶具特有的紫外吸收光谱、荧光光谱和氨基酸组成.通过Western 杂交的方法检测到β-1,3葡聚糖酶仅存在于种子中而在根、茎、叶中未见分布.     

盾壳霉几丁质酶和葡聚糖酶酶动力学性质初步研究

盾壳霉几丁质酶和葡聚糖酶酶动力学性质研究表明:几丁质酶和葡聚糖酶的酶促反应,在本试验计量范围内,其反应速度与酶量和底物浓度均呈正相关,但两种酶促反应适宜的温度和pH值有较大差。几丁质酶降解几丁质的最适反应温度为50℃,最适pH值为8.0,葡聚糖酶降解葡聚糖的最适反应温度为60℃,最适pH值为3.0。     

木质层孔菌产木聚糖酶和β-葡聚糖酶的研究

研究了木质层孔菌不同发酵条件对木聚糖酶、β-葡聚糖酶性能的影响,并对其酶作用特性进行了研究结果表明:木质层孔菌产木聚糖酶最适碳源为麸皮,氮源为蛋白胨,最适发酵温度为25℃;而产β-葡聚糖酶最适碳源为木糖,氮源为酵母膏,最适发酵温度为28℃。就产酶时间而言,在发酵前60 h菌株均不产生β-葡聚糖酶和木聚糖酶,在72 h才有微量的酶产生,到192～240 h两种酶均达到产酶高峰,并以216h产酶最高;两种酶的最佳缓冲液均为柠檬酸缓冲液,木聚糖酶的最适作用pH值5.0,最适反应温度为50℃,而β-葡聚糖酶最适作用pH值4.6,最适反应温度为60℃。     

嗜热纤维素分解菌TH3-9诱变选育及产酶条件初步研究

以嗜热侧孢霉(Thermophilic sporotrichum)为出发菌株进行紫外诱变,选育出TH3-9突变株。该菌株的CMCase和FPAase分别提高到原始菌株的2.6和2.0倍。液体培养产酶条件及正交试验研究结果表明,最适碳源为稻草粉+甘蔗渣(总含量为2.0%时,稻草粉∶甘蔗渣为1∶4),最适氮源是蛋白胨(0.4%),KH2PO4最适含量为0.3%,MgSO4.7H2O最适含量为0.03%,最适pH值为5.5,最适培养温度为45℃,培养第2天FPAase最高,培养第4天CMCase最高。采用优化配方,在45℃下培养,测得CMCase为86.8 IU,FPAase为22.6 IU。     

来源于脂环酸芽孢杆菌的GH1家族β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性分子改造

豆粕中大豆异黄酮主要以无活性的结合型存在。在玉米豆粕型日粮为主的饲料领域,β-葡萄糖苷酶可以将结合型大豆异黄酮转化为游离型活性苷元,但转化过程受肠道中较高浓度葡萄糖的抑制。和GH3家族相比,GH1家族β-葡萄糖苷酶不仅具有较高的葡萄糖耐受性,而且一定浓度范围内的葡萄糖对其具有酶活促进效应,因此在饲料领域显示出巨大的应用潜力。从脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.A4中克隆表达了一个具有较高葡萄糖耐受性(IC50800 mmol/L)的GH1家族β-葡萄糖苷酶As BG1。为了进一步提高As BG1的葡萄糖耐受性,通过同源建模、序列比对、分子对接技术等生物信息学手段,聚焦于催化通道的非催化葡萄糖结合位点,对As BG1进行了理性设计的分子突变研究。对不同突变体的葡萄糖耐受性测定表明:以5 mmol/L p NPG为底物,100 mmol/L葡萄糖对WT(野生型)、H315R和M325K酶活促进作用分别为125%、163%和162%,其中H315R的IC50提高至1 200 mmol/L;以1 mmol/L大豆苷为底物,10 mmol/L的葡萄糖对WT、H315R和M325K分别具有163%、212%和226%的酶活促进作用,结果表明突变体具有更好的在动物胃肠道水解大豆异黄酮能力。上述结果丰富了对GH1家族葡萄糖耐受性机制的认识,为日后进行耐受性相关的分子改造提供了重要的指导意义。     

Achaetomium sp.Xz8来源的甘露聚糖酶Man5Xz8 热稳定性的研究

嗜热真菌Achaetomium sp. Xz8来源的甘露聚糖酶Man5Xz8和Humicola sp.Y1来源的嗜热甘露聚糖酶Man5A氨基酸序列一致性高达90.0%,然而两者的酶学性质尤其是最适温度和热稳定性却存在着很大的不同。Man5Xz8的最适温度为50℃,仅在30℃下保持稳定,而Man5A最适温度为70℃,且在50℃下具有良好的热稳定性。为研究不同区域关键氨基酸位点对甘露聚糖酶热稳定性的影响,以Man5Xz8为研究材料,通过生物信息学方法分析,分别构建了单点突变体V124I及△SG。实验结果表明,突变体V124I及△SG和原酶Man5Xz8具有相似的最适pH和最适温度,但在热稳定性方面较原酶有很大提高：在50℃下处理10 min后,突变体V124I的相对剩余酶活力较原酶Man5Xz8提高了26.9%,突变体△SG在50℃下处理1 h保持稳定。通过对甘露聚糖酶不同区域氨基酸位点的研究,发现了与酶热稳定性相关的关键结构区域及位点,为以后更好的研究第5家族的甘露聚糖酶提供了一定的理论指导。     

黄孢原毛平革菌茶皂素脱色酶的粗分离及酶学性质

对黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)TS 07发酵液中的茶皂素脱色酶进行粗分离,并对其酶学性质进行了研究。结果表明: 用硫酸铵沉降法所得粗酶粉的酶活力高达52 971 U·g-1;该酶的最适反应温度为40℃,最适作用pH值为45;该酶在常温下具有良好的热稳定性,在pH值30～75环境下都比较稳定;Fe3+、Ca2+和Ni2+对酶活影响不大,Hg2+能强烈抑制茶皂素脱色酶的活性;10%(V/V)有机溶剂丙酮、异丙醇、乙醇和乙腈能保留茶皂素脱色酶大部分的活力;反应体系中H2O2达到5%,茶皂素脱色酶仍能保持较高的活力;而在反应底物不存在的情况下,茶皂素脱色酶与025%的H2O2保温1 h后,酶活残余量仍能达到80%以上。     

来源于青霉Penicillium sp. C6的β-1,3(4)-葡聚糖酶基因的克隆及酶学性质分析

从青霉Penicillium sp. C6菌株基因组DNA中克隆到一个新的16家族的葡聚糖酶基因,命名为bglc6(GenBank登录号:JX854434)。其cDNA全长为1 044 bp,包含N端前20个氨基酸的信号肽序列和一个16家族的结构催化域。bglc6编码的氨基酸序列与Grosmannia clavigera kw1407的假设葡聚糖酶蛋白序列最高一致性为64%。成熟蛋白BglC6在毕赤酵母中已成功表达,酶学性质分析表明,BglC6最适pH为4.5,最适温度为50℃,在酸性范围内具有良好的稳定性。以大麦葡聚糖酶为底物时,BglC6的比活、Km及Vmax值分别为253.8 U/mg,8.42 mg/mL,478.4 μmol/min·mg。蛋白BglC6对大多数金属离子有较好的抵抗能力。因此,该葡聚糖酶在动物饲料行业领域中具有潜在的应用前景。     

黑曲霉突变株与野生株的木聚糖酶酶学特性比较研究

黑曲霉(Aspergillus niger J506)是经过紫外线诱变得到的突变株．电泳结果表明,突变株粗酶液中蛋白质的种类与野生株差别较大;木聚糖酶谱检测发现,突变株粗酶液中有3种类型木聚糖酶,而野生株中只有2种．试验还表明,突变株粗酶液中木聚糖酶活性比野生株提高了约30％,突变株木聚糖酶最适pH值为6．0,在6．0～10．0范围内稳定,野生株木聚糖酶最适pH值为5．4,在7．0～10．0范围内稳定;突变株与野生株木聚糖酶的最适温度均为52℃,在20～50℃之间都比较稳定;突变株木聚糖酶的t1／2为55℃,野生株为53．5℃;在40℃保温24h,突变株剩余酶活性为86％,野生株为57％．     

一株嗜酸真菌的分离鉴定及其胞外糖苷水解酶的产酶分析(英文)

[目的]分离鉴定1株嗜酸真菌,研究其所产嗜酸酶。[方法]利用寡营养嗜酸(pH 2.5)选择性培养基,从江西某铀矿浸铀体系中分离到1株异养菌,记为RBS-6,利用其菌落形态和分子指标rDNA-ITS对其进行鉴定,并分析了其胞外糖苷水解酶。[结果]该菌最适生长pH值为4.0,属嗜酸性真菌。RBS-6的rDNA-ITS序列与瓶霉属真菌 Phialophora sp. CGMCC 3329(GU 082377)同源性最高,达到98%,故RBS-6为瓶霉属真菌(Phialophora),将其暂命名为Phialophora sp. RBS-6。该菌株可产α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶等6种糖苷水解酶,这些酶的最适pH值在3.0～4.0,为嗜酸酶,其中的β-葡聚糖酶最适pH值为3.5,最适温度为50℃,在50 ℃保温60min,仍有58%的酶活力,具有一定的热稳定性。[结论]该研究鉴定了所得菌株为嗜酸瓶霉属真菌,其为极具产嗜酸酶潜力的新型菌株,该结果丰富了瓶霉属真菌的研究。     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶gene02524的酶学性质及抑菌活性

几丁质酶是催化降解几丁质的水解酶,在防治植物真菌病害与虫害方面的应用越来越广泛,是一种重要的生防蛋白。棘孢木霉TD3104是一株优良的植物病害生防菌,几丁质酶在抑菌防病过程中发挥重要作用。为克隆表达棘孢木霉TD3104几丁质酶基因gene02514,明确酶学性质和抑菌活性,利用毕赤酵母表达系统对目的蛋白进行表达,并通过SephadexG-100凝胶进行纯化,对序列进行分析并研究其酶学性质及进行体外抑菌试验。本研究成功地构建了pPIC9K/gene02524重组载体,并且经过比对发现其包含GH18家族的特征氨基酸序列,获得了毕赤酵母转几丁质酶基因工程菌,表达的重组几丁质酶表观分子量44.4 ku,K_m=2.048 2 g/L,V_max=0.635 5×10³μmol/（L·min）,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.0,在pH值为3.5时稳定性最高;金属离子Cu²⁺、Hg²⁺可强烈抑制酶活性;可抑制金黄壳囊孢菌等病原真菌的生长。研究结果为解析棘孢木霉几丁质酶在生防中的作用及功...     

毕赤酵母产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵优化及酶学性质研究

对毕赤酵母表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶条件进行优化,在摇瓶水平上研究了温度、pH、甲醇流加量、诱导时间,油酸等因素对重组葡聚糖酶的影响;得优化条件为:最适温度30℃、pH6.0,最佳甲醇诱导浓度为0.5%,最佳诱导时间为84h,酶活力达27.4U/mL,比初始酶活力提高了1.9倍。酶反应的最适pH为6.0,最适温度为50℃。在pH3.5～8.0的范围内和温度55℃以下保存时具有较好的稳定性;其中,CaCl2对重组酶的激活效果显著,使酶活力提高达92%。     

纤维素降解菌中葡聚糖酶基因的克隆表达及活性

为探明约氏梭菌(Clostridium josui)中纤维小体内某个酶的功能性,从该菌属CJ-1菌株中克隆出基因片段Cel9C,大小为1943 bp,编码647个氨基酸,将该基因构建于大肠杆菌表达载体p ET28a(+)中,获得重组表达载体p ET28a-Cel9C,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行表达。结果表明,该酶的最适反应温度为45℃,最适反应p H为p H6.0;对大麦-β-葡聚糖(Barley-β-glucan)和魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan)具有较高的反应活性,比活值分别达到114和57 U·mg-1;几乎不能以木聚糖(Brichwood xylan)和半乳甘露寡糖(Galacto mannan)为底物。说明该酶对葡聚糖类物质时有较高的降解能力,应为葡聚糖酶。