铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树为试材,对其中E3泛素连接酶基因进行克隆和生物信息学分析,并采用qPCR进行不同干旱条件下的定量表达分析。研究结果表明,该序列全长为1 138bp,开放阅读框(ORF)为810bp,编码269个氨基酸(GenBank登录号KR819177)。生物信息学分析发现该铁观音茶树E3泛素连接酶基因不含跨膜结构以及信号肽,具有多个磷酸化位点,亚细胞定位于叶绿体中。经BLAST比对,该基因编码的氨基酸序列与烟草、亚麻荠、葡萄、醉蝶花、芜菁中的E3泛素连接酶基因编码的氨基酸序列分别有51%、50%、50%、50%和49%的同源性,且相关保守功能结构域翻译的蛋白质序列具有RING-finger结构,初步确定该基因为铁观音茶树的E3泛素连接酶基因。qPCR分析结果显示在不同干旱胁迫处理下铁观音茶树的E3泛素连接酶基因的表达量,与对照组相比显著增加。本研究认为铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因参与茶树抗旱响应机制。     

龙葵E2泛素结合酶基因SorUBC克隆及表达特性分析

对龙葵Sor UBC基因克隆并分析其在多种非生物胁迫处理下表达特性,为E2泛素结合酶在植物逆境胁迫中应用提供理论依据。试验采用电子克隆结合RT-PCR方法从龙葵中克隆得到泛素E2结合酶UBC基因编码区序列,命名为Sor UBC,登陆Gen Bank,编号:KU233684。Sor UBC基因编码区全长888 bp,编码295个氨基酸。进化树分析显示,该基因编码氨基酸序列与马铃薯、番茄同源性最高,为95%,其次是烟草,为91%。该蛋白在第266~284氨基酸位具有1个跨膜螺旋区域,泛素化位点预测表明其含有8个泛素化位点。利用荧光定量PCR技术分析Sor UBC基因在龙葵各器官表达特征和不同非生物胁迫处理下(干旱、盐、碱、高温和低温)根部和叶片表达特性,同时测定龙葵叶片生理响应。结果表明,SorU BC基因表达具有组织差异性,在叶片和果实中表达量较高。非生物胁迫处理(干旱、盐、碱、高温和低温)后根部和叶片基因表达情况显示该基因存在早期(3或5 h)应答上调表达,且根部与叶片基因表达量和变化趋势差异显著,根部表达量变化比叶片显著,推测Sor UBC基因在龙葵早期响应干旱、盐、碱、高温和低温非生物胁迫中起调控作用。生理特征数据表明,在干旱、盐和高温胁迫中龙葵叶片MDA含量变化差异不显著,POD和SOD活性总体呈先降后升趋势,说明其在胁迫后期(9 h)对活性氧造成的损伤起缓解作用。     

玉米ZmWRKY41基因克隆及转录激活验证

[目的]干旱是影响作物生长发育及产量的重要因素。植物WRKY转录因子超家族在植物的生长发育、响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用。因此,克隆分析玉米WRKY转录因子的序列特征和功能,为研究玉米耐逆分子育种提供重要抗逆基因资源。[方法]本研究以玉米自交系B73为材料提取玉米总RNA反转录cDNA,克隆、分离获得ZmWRKY41基因编码区全长序列。DNAMAN比对发现,ZmWRKY41蛋白具有保守结构域WRKYGQK和锌指结构域(zinc-finger motif)C2HC,属于第三类WRKY转录因子家族。利用生物信息学方法研究该基因蛋白质理化性质,并对其进行结构分析预测。利用PlantCARE在线工具预测、鉴定ZmWRKY41基因启动子区是否含有响应非生物胁迫的顺式作用元件。将ZmWRKY41基因编码区全长序列构建pGBKT7诱饵载体上,与GAL4DNA结合域融合,转化酵母菌株AH109验证ZmWRKY41转录因子转录激活活性。[结果]玉米ZmWRKY41基因编码区全长774bp,含有长度分别为221bp、126bp、427bp 3个外显子,共编码257个氨基酸序列。蛋白质高级结构预测发现,ZmWRKY41蛋白包含2个α-螺旋结构和5个β-折叠结构,不含跨膜结构和信号肽。ZmWRKY41基因启动子元件预测发现,该启动子中含有干旱胁迫(CGGTCA)、热胁迫(AAAAAATTTC)、低温胁迫(CCGAAA)等非生物逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。酵母转录激活验证实验显示,将含有pGBKT7-ZmWRKY41融合表达载体转化酵母AH109菌株,能在单缺、三缺培养基正常生长且能使α-半乳糖苷酶底物分解显蓝色,表明ZmWRKY41基因具有转录激活活性。[结论]玉米ZmWRKY41基因是WRKY转录因子基因家族成员之一,在酵母体内具有转录激活活性,可能参与响应非生物逆境胁迫,为进一步研究该转录因子调控非生物逆境胁迫奠定基础。     

大豆转录因子GmDof1.5的克隆与非生物胁迫诱导表达

Dof转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用。利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个功能未知的Dof转录因子基因GmDof1.5,该基因位于大豆基因组15号染色体上,ORF全长540 bp,编码含有179个氨基酸的蛋白质,相对分子质量为20.15 ku,等电点为9.82。蛋白序列预测发现,GmDof1.5蛋白含有一个典型Zf-Dof结合域,且含有大量磷酸化位点。蛋白系统进化分析表明,大豆GmDof1.5与豆科植物鸡血藤SsDof4的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,ABA、干旱、高盐、高温和低温胁迫均可不同程度地诱导GmDof1.5的表达,且GmDof1.5对高温胁迫的响应最为显著。     

小麦HP基因家族鉴定和分析

组氨酸磷酸转运蛋白HP(histidine phosphotransfer proteins)在植物的生长发育调控及逆境胁迫应答中发挥重要作用。为理解HP基因在小麦基因组中的进化特征和功能,研究通过生物信息学分析鉴定普通小麦的HP基因家族成员,对其理化性质、进化特征、基因结构、顺式作用元件以及在逆境胁迫条件下的表达模式进行了分析。结果表明,在小麦基因组鉴定到31个HP基因,编码蛋白质序列包括116～200个氨基酸。通过和其他植物的HP蛋白比较以及对蛋白结构、基因结构和基序的分析,显示小麦HP家族基因序列具有保守性。顺式作用元件预测表明,HP基因具有光、植物激素、干旱、低温等非生物胁迫响应相关的启动子调控元件。热图分析表明,HP基因在应答非生物胁迫中表达模式存在多样性;qRT-PCR分析表明,TaHP5-6B基因在低磷胁迫下受到强烈的诱导表达。综上所述,小麦全基因组鉴定的HP家族基因是非生物胁迫响应的重要基因资源。     

一个新的小麦非生物胁迫诱导基因的克隆及表达特性

 【目的】水分胁迫和低温是制约植物生长发育的重要限制因子，研究植物感知、传递胁迫信号，并对重要的基因进行克隆对改良作物的抗性有重要意义。本试验的目的是克隆与水分胁迫相关的基因，通过基因的功能进一步了解植物的抗旱机制，并为抗逆育种提供候选基因。【方法】试验应用噬菌体原位杂交技术从小麦旱胁迫cDNA文库中克隆了一个水分胁迫诱导基因片段W89。用5′-RACE和RT-PCR方法，获得了W89基因的全长序列。【结果】W89全长cDNA为2 392 bp，其中，编码区长1 896 bp，编码631个氨基酸。Southern杂交表明，W89是一个单拷贝基因。RT-PCR结果表明，W89受干旱、低温和ABA的诱导。氨基酸序列分析发现W89有一个DUF248保守区（pfam03141），包含一个具有SAM （Sterile Alpha Motif）结合基序的甲基转移酶区。同源性分析发现W89与一个水稻干旱诱导蛋白（BAD67956）的同源性为66%，推测W89可能是一个新的小麦干旱诱导的基因。【结论】根据甲基转移酶和SAM结合基序的功能，推测W89的SAM结合基序可能与其它蛋白或转录因子相互作用调控植物胁迫基因的表达，并且可能在干旱胁迫的早期调控信号的转导。     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。     

苦荞转录因子FtNAC15基因的克隆及表达分析

为研究NAC转录因子在苦荞中的功能,从苦荞发育种子中克隆了一个NAC家族基因,其开放阅读框全长1 098 bp,编码365个氨基酸,将其命名为FtNAC15。基因结构分析表明:FtNAC15基因由3个外显子和2个内含子组成。氨基酸序列多重比对和进化关系分析表明:FtNAC15蛋白与水稻ONAC003、拟南芥ANAC010和ANAC073亲缘关系较近,属于NAC家族转录因子家族中同一亚组。基因上游启动子序列顺势作用元件分析表明:该基因启动子中的顺式作用元件可以分为5类,即启动子核心元件、节律和光照响应元件、转录因子结合位点、非生物胁迫响应元件和激素响应元件。表达分析表明:FtNAC15基因在种子发育的成熟期和干旱胁迫下上调表达,表明其参与调控荞麦种子发育和响应干旱胁迫。     

枣树novel-miR16靶基因ZjTCP4鉴定及生物信息学分析

TCPs转录因子主要通过调节细胞增殖和植物激素途径来调控植物器官发生和形态构型,探究枣树ZjTCP4转录因子的序列特征及其表达特性,以期为TCP转录因子响应干旱胁迫的机理研究提供参考,也可以为后续对枣树分子育种奠定基础。novel-miR16的二级结构具有miRNA典型的发夹结构,为枣树miR319家族成员;靶基因ZjTCP4的降解位点多数都在novel-miR16结合位点的第10和11个核苷酸的位置;生物信息学分析表明,ZjTCP4基因的全长cDNA序列为1 386 bp,预测编码452个氨基酸的多肽,预测编码蛋白的等电点(pI)为6.51,分子量为49 091.55 u;应该是一个膜内或膜外蛋白,为非分泌性蛋白,为亲水性蛋白质,定位于细胞核;枣树ZjTCP4基因编码的氨基酸序列与拟南芥AtTCP4最为相似,与拟南芥AtTCP17,AtTCP18和AtTCP12的相似性也较高;枣树novel-miR16在响应干旱胁迫的过程中上调表达,而其靶基因ZjTCP4在干旱胁迫下下调表达。枣树novel-miR16通过靶向调控ZjTCP4转录因子响应干旱胁迫,干旱胁迫下枣树novel-miR16...     

紫大麦草中DREB类转录因子基因Hvi917DREB2的克隆、原核表达及序列分析

DREB类转录因子是一类与植物逆境胁迫响应相关的重要蛋白,本研究利用同源克隆方法和RACE技术从紫大麦草(Hordeum violaceum)中分离到1个DREB类转录因子基因,命名为Hvi917 DREB2。序列分析表明Hvi917 DREB2基因含有1个792bp的开放阅读框,编码264个氨基酸残基,含有1个保守的AP2结构域,属于AP2大家族。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中短芒大麦草AP2蛋白HbDREB2、DREB1(登录号分别为:AAU29412.1和AER42620.1)具有99%的氨基酸序列一致性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了1个分子量为34.5kD的蛋白。