棉铃虫过氧化物还原酶基因Prx4的鉴定及功能分析

为探究过氧化物还原酶（peroxiredoxin,Prx）在棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫体内的功能,利用转录组数据鉴定得到了棉铃虫Prx4基因,并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）测定该基因在棉铃虫不同发育阶段和5龄幼虫不同组织中的相对表达,利用原核表达和RNA干扰方法探究该基因的功能。结果表明,Prx4基因开放阅读框长为744 bp,编码248个氨基酸,系统进化树和同源序列多重比对结果显示该基因属于典型的2-Cys过氧化物酶家族;Prx4基因广泛分布于棉铃虫幼虫各组织和发育阶段中;当感染核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus,NPV）后,棉铃虫Prx4基因相对表达量上调;重组蛋白的体外试验表明Prx4蛋白具有一定的抗氧化活性;与对照相比,小干扰RNA处理6、8和10 d后感病棉铃虫的死亡率分别较对照显著提高了4.46%、22.42%和38.68%。表明Prx4基因作为一种抗氧化酶保护棉铃虫免受氧化损伤,同时在抵御NPV感染过程中发挥着重要的免疫作用。     

棉铃虫羧酸酯酶基因HaCarE序列分析及其RNAi效应

为明确棉铃虫Helicoverpa armigera羧酸酯酶（carboxylesterase,CarE）编码基因的功能及其RNA干扰（RNA interfering,RNAi）效应,通过棉铃虫转录组数据筛选获得CarE基因,并克隆得到其全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（quantitative real-timePCR,qPCR）技术检测该基因在棉铃虫不同发育时期和不同组织中的表达水平,同时通过RNAi技术检测其对棉铃虫的致死效果。结果表明,从棉铃虫中克隆获得的HaCarE基因全长cDNA序列为1 677 bp,编码558个氨基酸,编码蛋白质由15个α螺旋和14个β折叠结构组成。qPCR检测结果显示该基因在棉铃虫不同发育时期均有表达,其中在1龄幼虫期的相对表达量最高,随着龄期的增长,相对表达量逐渐降低,在6龄幼虫期和蛹期的相对表达量最低;在5龄幼虫不同组织中,该基因在中肠中的相对表达量最高。注射dsHaCarE能够明显抑制靶标基因的表达,24 h抑制率为75.41%;饲喂dsHaCarE对棉铃虫2龄幼虫有显著致死作用,5 d时死亡率为64.57%,体长与对照组相比减少了23.29%。表明获得的HaCarE基因对棉铃虫生长发育有显著抑制作用,并有较好的致死效果。     

棉铃虫BR-C Z4基因的克隆及表达分析

为明确转录因子广泛锌指复合物（broad-complex,BR-C）Z4亚型在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育过程中的作用,基于2-十三烷酮（2-tridecanone,2-TD）处理的棉铃虫幼虫中肠转录组数据克隆获得BR-C Z4的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,对其氨基酸序列和编码蛋白质进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR）技术分析BR-C Z4基因在棉铃虫不同龄期、不同组织和2-TD处理6龄幼虫中的表达规律以及其和Ⅳ型几丁质酶（chitinase IV,CHT4）编码基因在4~6龄初、末期幼虫中的表达规律。结果表明,克隆获得的棉铃虫BR-C Z4基因的ORF为1 347 bp,编码448个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量和理论等电点分别为49.8 kD和7.75,且主要定位于细胞核中。系统进化分析结果显示,棉铃虫BR-C Z4与家蚕Bombyx mori和烟草天蛾Manduca sexta的BR-C Z4亲缘关系最近。BR-C Z4基因在棉铃虫整个生长期均有表达,在3龄期的相对表达量最低而在预蛹期的相对表达量最高;该基因在棉铃虫6龄幼虫的脂肪体、中肠、体壁和头部均有表达,在头部的相对表达量最低,在中肠中的相对表达量最高; BR-C Z4和CHT4基因在棉铃虫4~6龄末期幼虫中的相对表达量均显著高于4~6龄初期幼虫;相关性分析结果显示BR-C Z4和CHT4的相对表达量呈极显著正相关;随着2-TD处理浓度的增加,棉铃虫BR-C Z4基因的相对表达量总体呈现先上升后下降的趋势,其中15 mg/g浓度处理20 h时BR-C Z4基因相对表达量达到峰值,而20 mg/g浓度处理6 h时BR-C Z4基因相对表达量降到最低,为对照的22.73%。推测BR-C Z4基因在棉铃虫变态发育和应对2-TD胁迫过程中发挥着重要作用。     

棉铃虫表皮蛋白基因CP22和CP14的表达特征及其对甲氧虫酰肼的响应

为揭示棉铃虫Helicoverpa armigera表皮蛋白（cuticular protein，CP）基因在其生长发育及应对药剂胁迫中的作用，克隆棉铃虫2个CP基因CP22和CP14，利用实时荧光定量PCR技术分析其在不同发育阶段和不同组织中的相对表达量，并于显微镜下观察甲氧虫酰肼亚致死剂量处理后棉铃虫3龄幼虫的表皮形态，并用实时荧光定量PCR技术测定药后CP22和CP14基因的相对表达量。结果显示，CP22和CP14的开放阅读框全长分别为570 bp和393 bp，分别编码189个和130个氨基酸；CP22和CP14都具有1个几丁质结合域，属于CPR家族RR-1亚类；CP22和CP14基因均在棉铃虫5龄幼虫表皮中表达水平高；这2个基因在棉铃虫幼虫期的表达水平高于在卵期、蛹期和成虫期的表达水平，且在4龄幼虫体内表达量最高，在蜕皮后随着日龄的增加表达量逐渐降低；甲氧虫酰肼处理后棉铃虫3龄幼虫表皮黑化、皱缩，发生蜕皮异常，显微观察显示其内外表皮分离，真皮细胞解体；甲氧虫酰肼处理后24 h和48 h，棉铃虫CP22和CP14基因的相对表达量显著上调。表明棉铃虫CP22和CP14基因参与棉铃虫幼虫蜕皮，并且响应甲氧虫酰肼胁迫，可作为防治棉铃虫的潜在靶标基因。     

黏虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆及抗球孢白僵菌功能分析

为探究丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,Serpin）基因在黏虫Mythimna separata生长发育及免疫防御等过程中发挥的作用,在黏虫转录组中获得Serpin基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR技术分析Serpin在黏虫不同发育阶段和不同组织中的表达水平,并通过RNA干扰技术分析Serpin在黏虫抗球孢白僵菌Beauveria bassiana过程中发挥的作用。结果显示,获得2个黏虫Serpin基因,命名为MsSerpin-4和Mserpin-5,其cDNA全长序列分别为1 938 bp和2 618 bp,开放阅读框分别为1 188 bp和1 197 bp,分别编码395个和398个氨基酸,GenBank登录号分别为MZ577062和MZ577063。2个基因在黏虫不同龄期和不同组织内均有表达,在成虫期的相对表达量最高,在1龄幼虫期的相对表达量最低;在中肠中的相对表达量最高,在唾腺中的相对表达量最低。RNA干扰6 h时对MsSerpin-4和Mserpin-5表达的抑制效果最好,抑制率分别为52.57%和49.15%;MsSerpin-4和Mserpin-5的表达被抑制后,黏虫对球孢白僵菌更敏感,校正死亡率分别提高了31.47%和14.62%。表明黏虫2个MsSerpin均参与了被球孢白僵菌侵染后的免疫反应,可为后续黏虫的生物防治提供新靶标。     

棉铃虫BR-C Z2基因的克隆、原核表达及其表达谱

为明确转录因子广泛锌指复合物（broad complex,BR-C）在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育过程中的作用,基于转录组序列从棉铃虫幼虫中肠克隆获得BR-C Z2的cDNA序列并对其氨基酸序列和蛋白结构进行生物信息学分析,利用原核表达系统表达其融合蛋白;用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）技术分析BR-C Z2基因在棉铃虫体内的表达规律,以及2-十三烷酮（2-tridecanone,2-TD）处理后其在棉铃虫6龄幼虫中肠内的变化规律。结果显示,棉铃虫BR-C Z2基因的开放阅读框为1 257 bp,编码418个氨基酸,预测编码蛋白的分子量和理论等电点分别为46.63 kD和6.94,主要定位于细胞核中。系统进化树结果显示棉铃虫BR-C Z2与家蚕Bombyx mori的BR-C Z2亲缘关系最近。成功表达His-HaBR-C Z2融合蛋白。BR-C Z2基因在棉铃虫蛹期和6龄幼虫中肠组织中相对表达量最高;不同浓度2-TD处理后,棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量变化趋势不同,其中15 mg/g浓度处理12 h后棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量达到峰值,是对照的2.5倍,而20 mg/g浓度处理20 h后棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量降到最低,为对照的45.13%。表明BR-C Z2基因可能参与棉铃虫的生长发育,并响应2-TD的胁迫。     

棉铃虫ATP合酶亚基α对Cry2Ab毒理的影响

为探究棉铃虫Helicoverpa armigera ATP合酶亚基α（ATP synthase subunit α,ATPs-α）对Cry2Ab毒理的影响,采用实时荧光定量PCR技术检测了ATPs-α基因在棉铃虫幼虫不同发育阶段、不同组织及受Cry2Ab诱导后的表达量,并通过在昆虫细胞中过表达和干扰ATPs-α基因验证其在Cry2Ab毒理中的功能。结果显示：ATPs-α基因在棉铃虫各发育阶段和组织中普遍表达,其中在幼虫的1龄和2龄期,以及5龄的中肠、头部和表皮中表达较高。棉铃虫取食Cry2Ab 6 h后,ATPs-α基因表达量开始显著降低,一直持续到36 h;在Sf9细胞系中成功表达ATPs-α蛋白后,显著增强了Cry2Ab的细胞毒力;在美洲棉铃虫H.zea的中肠细胞中干扰ATPs-α基因后,显著降低了Cry2Ab的细胞毒力。表明棉铃虫ATPs-α参与Cry2Ab的毒理过程。     

多杀霉素亚致死浓度对棉铃虫幼虫生理及代谢的影响

为明确田间使用多杀霉素亚致死浓度对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫的影响,用含多杀霉素亚致死浓度LC₂₅的人工饲料持续饲喂棉铃虫3龄幼虫,并对饲喂后其体重、取食量、累计蛹化率、蛹发育历期和蛹重等生长发育及脂肪体内甘油三脂（triglyceride,TG）含量和相关基因SREBP、FAS和HSL表达情况进行测定。结果表明,多杀霉素对棉铃虫的亚致死浓度LC₂₅为0.21 mg/kg;多杀霉素亚致死浓度处理4~6 d后,棉铃虫3龄幼虫体重分别为0.065、0.263和0.329 g,较对照显著降低;处理6 d后,其取食量为0.082 g,较对照显著降低;处理4~7 d后,其累计化蛹率分别为60.90%、63.20%、65.50%和65.50%,较对照显著降低。多杀霉素亚致死浓度处理后,棉铃虫蛹发育历期由对照9.89 d显著延长至10.74 d,单头蛹重为0.274 g,显著低于对照的0.324 g;其脂肪体TG含量较对照显著降低。多杀霉素亚致死浓度处理24~72 h后,参与脂肪酸合成信号通路中重要基因SREBP和FAS的相对表达量较对照均显著下调,而参与脂肪代谢的重要基因HSL则较对照显著上调。     

核型多角体病毒与中红侧沟茧蜂对寄主棉铃虫的联合效应

为明确寄生蜂中红侧沟茧蜂Microplitis mediator与核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus,NPV）对寄主棉铃虫Helicoverpa armigera的联合效应,测量中红侧沟茧蜂和NPV单处理及复合处理后棉铃虫幼虫的形态学指标,并统计棉铃虫幼虫死亡率及寄生蜂中红侧沟茧蜂子代存活率。结果显示,处理3 d和5 d后,中红侧沟茧蜂和NPV单处理及复合处理的棉铃虫幼虫体长、体宽、头壳宽度、体重均显著低于对照,但各处理之间差异不显著。接入浓度为2.5×10⁴ OBs/mL和2.5×10⁶ OBs/mL NPV时,中红侧沟茧蜂和NPV这2种生防因子对棉铃虫均表现为拮抗效应或累加效应。接入浓度为2.5×10⁴ OBs/mL NPV时,先寄生后接毒和先接毒后寄生处理的棉铃虫实际死亡率分别为4.35%和14.26%;接入浓度为2.5×10⁶ OBs/mL NPV时,棉铃虫实际死亡率则分别为31.55%和94.19%,先接毒后寄生处理的棉铃虫实际死亡率均显著高于先寄生后接毒处理的实际死亡率。接入浓度为2.5×10⁶ OBs/mL NPV时,先寄生后接毒和先接毒后寄生处理的寄生蜂子代存活率分别为54.51%和3.71%,前者显著高于后者。表明中红侧沟茧蜂寄生和NPV侵染均能显著抑制棉铃虫的生长发育,但两者联合应用时拮抗效应明显且对寄生蜂子代有影响,同时用于生物防治棉铃虫时应谨慎。     

马铃薯羧肽酶抑制剂与Cry1Ac毒素混用对棉铃虫中肠蛋白酶活性及杀虫活性的影响

为研发转多价抗虫棉,利用蛋白酶专性底物测定马铃薯羧肽酶抑制剂（potato carboxypeptidases inhibitor,PCI）和Cry1Ac毒素单用及混用后棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和羧肽酶的活性、羧肽酶A（carboxypeptidase A,CPA）和羧肽酶B（carboxypeptidase B,CPB）基因的相对表达量及对棉铃虫的杀虫活性。结果表明,饲喂20 μg/cm² PCI+1 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+5 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,棉铃虫3龄幼虫中肠内CPA活性分别为0.20 U/mg和0.16 U/mg,显著低于对照;总蛋白酶活性均为0.15 OD·min^-1·mg^-1,与对照差异不显著;类胰蛋白酶活性均为0.45 μmol·min^-1·mg^-1,均显著低于其他处理,CPB基因表达量较对照显著下调。饲喂20 μg/cm² PCI、40 μg/cm² PCI、1 μg/cm² Cry1Ac、5 μg/cm² Cry1Ac、20 μg/cm² PCI+1 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+5 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,CPB活性分别为0.26、0.26、0.24、0.26、0.27和0.26 U/mg,与对照差异不显著;棉铃虫3龄幼虫中肠内类胰凝乳蛋白酶活性分别为0.48、0.39、0.42、0.41、0.40和0.45 μmol·min^-1·mg^-1,6者之间差异不显著,但均显著低于对照;棉铃虫3龄幼虫中肠内CPA基因表达量均较对照显著上调。饲喂20 μg/cm² PCI+0.02 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+0.02 μg/cm² Cry1Ac、20 μg/cm² PCI+0.06 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+0.06 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,棉铃虫初孵幼虫实际校正死亡率分别为66.54%、68.28%、77.74%和85.76%,均高于其预期校正死亡率,表明PCI和Cry1Ac两者对杀虫活性表现为独立作用和增效作用,两者可共同用于棉铃虫幼虫的防治。     

棉铃虫类肌钙蛋白基因的克隆、原核表达纯化及其时空表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)类肌钙蛋白基因HaCal的生理功能及其所编码蛋白的生物特性,采用PCR方法克隆了HaCal的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,借助在线软件对其进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达和纯化其编码的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术分析其在棉铃虫不同发育龄期和组织中的表达量。结果显示,HaCal的ORF序列长度为564 bp,编码187个氨基酸,理论分子量为20.52 kD,理论等电点为7.64。其保守结构域与Calponin家族一致,但不含跨膜区和信号肽,系亲水性蛋白。原核表达结果显示,融合蛋白大小与理论值一致,纯化获得了纯度较高的目的蛋白。HaCal在棉铃虫幼虫不同发育阶段和不同组织中均有表达,在6龄幼虫体内表达量最高,是1龄幼虫的2.34倍;在5龄幼虫中肠中表达量最高,是头部的257.14倍。表明棉铃虫类肌钙蛋白基因HaCal可能与棉铃虫的生长发育过程密切相关。     

棉铃虫V-ATP酶亚基A基因克隆及表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase,V-ATP酶)亚基A对棉铃虫生长发育的影响及其在Bt杀虫机制中的作用,采用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫V-ATP酶亚基A基因序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了其在棉铃虫不同发育历期和幼虫肠道不同组织中的表达量;并比较了4龄幼虫取食含Cry1Ac蛋白饲料后中肠中该基因表达量的变化。结果显示,棉铃虫V-ATP酶亚基A基因全长2 578 bp(Gen Bank登录号KP090287),开放阅读框1 863 bp,编码621个氨基酸。V-ATP酶亚基A高度保守,不同物种间氨基酸序列同源性大于90%。V-ATP酶亚基A在棉铃虫整个生育期都有表达,在4龄幼虫体内表达量最高,是卵期的3.00倍;在幼虫肠道不同组织中,中肠中表达量最高,是后肠中的2.65倍。4龄棉铃虫幼虫取食含Cry1Ac蛋白的人工饲料后,中肠V-ATP酶亚基A的表达受到抑制,表达量为对照的0.39~0.81倍。表明V-ATP酶亚基A基因可能参与棉铃虫的生长发育和代谢过程,并可能与抵御Cry1Ac的毒杀作用有一定关系。     

大螟两个mGST1基因的时空分布及经氯虫苯甲酰胺诱导后的表达情况

为明确微粒体谷胱甘肽S-转移酶（microsomal glutathione S-transferase,mGST）是否参与大螟Sesamia inferens对氯虫苯甲酰胺的解毒代谢，采用Illumina深度测序技术分析大螟转录组数据获得mGST1基因序列，利用实时荧光定量PCR技术测定其在大螟不同龄期幼虫和4龄幼虫不同组织中的表达模式，及经不同浓度氯虫苯甲酰胺处理不同时间后的相对表达量。结果表明，共获得2个mGST1基因序列，分别命名为SimGST1-1和SimGST1-2(GenBank登录号分别为OL770267和OL770268)。SimGST1-1和SimGST1-2的开放阅读框分别为456 bp和447 bp，分别编码152个和149个氨基酸，均具有昆虫mGST的特征序列。SimGST1-1和SimGST1-2在大螟不同龄期幼虫体内均有表达，且在4～6龄幼虫体内的相对表达量显著高于1～3龄幼虫。SimGST1-1在4龄幼虫中肠和脂肪体中的相对表达量显著高于在头部和表皮中的相对表达量，SimGST1-2在头部和中肠中的相对表达量显著高于在表皮和脂肪体中的相对表达量。与对照组...     

禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的克隆、分子特性和表达分析

为探究禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi (Linnaeus)水通道蛋白基因RpAQP1的序列特征及其在不同龄期的表达,利用RT-PCR和RACE技术克隆了RpAQP1基因的cDNA全序列,采用生物信息学软件分析了RpAQP1编码蛋白的特性,利用qRT-PCR分析了RpAQP1在不同龄期的表达量。结果显示:禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的cDNA全长为1 216 bp,其750 bp的开放阅读框编码250个氨基酸,蛋白分子量为27.36 kD。RpAQP1属于水通道蛋白亚家族DRIP(果蝇内嵌蛋白Drosophila integral protein)的一员,具有6个跨膜区,2个保守的NPA结构单元和1个压缩区域Ar/R;qRT-PCR结果显示,RpAQP1在整个发育历期均有表达,其在2龄若蚜中表达水平最高,是成蚜表达量的1.432倍;在4龄若蚜中表达量最低,为成蚜表达量的0.444倍,显著低于其它龄期,而其余各龄期RpAQP1表达量无显著差异。     

棉铃虫四个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达分析

为明确棉铃虫Helicoverpa armigera丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）的种类及其表达特性,利用PCR技术克隆棉铃虫的serpin基因,使用生物信息学软件预测其结构并进行系统进化分析,采用实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR,RT-qPCR）技术比较serpin基因在棉铃虫不同发育阶段和组织中的表达量及取食Cry1Ac后其表达量的变化。结果表明,共获得serpin-a、serpin-b、serpin-c、serpin-e四个棉铃虫serpin基因,全长为1 119~1 254 bp,编码373~418个氨基酸,均包含一段具有反应中心环的保守结构域,且与斜纹夜蛾Spodoptera litura、草地贪夜蛾S.frugiperda等鳞翅目昆虫serpin的同源性较高。serpin-a和serpin-e在棉铃虫4龄幼虫期的表达量最高,serpin-b和serpin-c分别在成虫期和蛹期表达量最高。serpin-a在中肠和围食膜中表达量最高,serpin-b在头、中肠和表皮中表达量最高,serpin-c在头部表达量最高,serpin-e在中肠和血淋巴中的表达量显著高于其他组织。棉铃虫取食低浓度Cry1Ac后,中肠的serpin-b和serpin-e的表达量显著增加。推测不同serpin基因在棉铃虫不同发育时期和组织中可能发挥不同的作用,其中serpin-b和serpin-e可能参与棉铃虫对Cry1Ac的解毒过程。