口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒OLZ02株基因组序列为材料，采用Garnier—Robson法、Chou-Fasman法和Karplus—Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构，用Kyte-Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性，Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性，Jameson—Wolf法预测了各蛋白的抗原指数，综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明，VPl蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多，是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原，但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位，有的甚至有可能成为优势抗原表位。     

口蹄疫病毒VP1基因的克隆及结构蛋白VP1的原核表达

根据Genbank中的O型口蹄疫病毒全基因序列设计了一对扩增口蹄疫病毒VP1基因的引物，用该特异性表达引物从口蹄疫阳性质粒pMD—P1中扩增得到目的基因VP1（639bp）。用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体PET32a后构建重组表达载体．转化宿主菌BL21（DE3），经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆．测序证明目的基因正确插入了表达载体，用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达，收集菌液进行SDS—PAGE电泳，Westerll—blotting分析蛋白免疫原性。结果表明，VP1结构蛋白在大肠杆菌中表达量较高，表达产物的分子量约为41Ku，并能被口蹄疫阳性血清所识别，经分析表达蛋白约占菌体蛋白的34％。口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有免疫原性。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的体外表达鉴定与蛋白结构分析

口蹄疫病毒为小RNA病毒科属的成员。其基因组为一约含8500个核苷酸的正链RNA，只有1个开放阅读框，编码1个原始翻译产物，该产物可被蛋白水解酶裂解为几个分子量较大的前体，包括P1、P2、P3、P4等。P1又可被病毒编码的蛋白水解酶裂解为VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白单位。由于VP1暴露于病毒颗粒的表面，所以研究工作最多的是VP1。该基因位于FMDV基因组的2977～3615核苷酸，编码213个氨基酸。     

猪圆环病毒II型结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测

本研究以猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)II型的基因组序列为材料,采用Garnier-Robson方法、Chou-Farplus方法和Karplus-Schulz方法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini方法预测了结构蛋白的表面可能性,以Jameson-Wolf方法预测了蛋白的抗原指数。然后综合评价了PCV-2型结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,PCV-2结构蛋白形成α螺旋结构的能力较差,但是该蛋白含有较多的β折叠和转角结构,因而该蛋白具有丰富的二级结构。分析结果还表明结构蛋白具有多处抗原指数较高的区段,其中羧基端含有潜在的B细胞优势抗原表位,因此其在免疫学中的地位也应当引起重视。本研究将为猪圆环病毒的反向疫苗学的研究提供一定的理论依据。     

猪圆环病毒Ⅱ型结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测

本研究以猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)Ⅱ型的基因组序列为材料,采用Gamier-Robson方法、Chou-Farplus 方法和Karplus-Schulz方法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini方法预测了结构蛋白的表面可能性,以Jameson-Wolf方法预测了蛋白的抗原指数.然后综合评价了PCV-2型结构蛋白的B细胞抗原表位.结果表明,PCV-2结构蛋白形成α螺旋结构的能力较差,但是该蛋白含有较多的β折叠和转角结构,因而该蛋白具有丰富的二级结构.分析结果还表明结构蛋白具有多处抗原指数较高的区段,其中羧基端含有潜在的B细胞优势抗原表位,因此其在免疫学中的地位也应当引起重视.本研究将为猪圆环病毒的反向疫苗学的研究提供一定的理论依据.     

鸭肝炎病毒VP1蛋白B细胞抗原表位预测及变异分析

以鸭肝炎病毒(DHV)SN株VP1基因序列为基础,运用Garnier-Robson、Chou-Fasman和Karplus-Schulz方法预测VP1蛋白的二级结构,并分别运用Kyte-Doolittle方法、Jameson-Wolf方法和Emini方法预测蛋白的亲水性、抗原指数和表面可及性,最后结合吴玉章的方法综合分析预测其B细胞抗原表位.结果显示,VP1蛋白C端第132～137、177～186、209～219区段有较好的亲水性、表面可及性和较高的抗原指数,并且在二级结构上含有易形成抗原表位的无规则卷曲和β-转角,可能是VP1蛋白的B细胞抗原优势表位;DHV SN株与弱毒疫苗株在推测的VP1 B细胞抗原表位177～186和209～219两个区域氨基酸序列变异较大.     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达与抗原性分析

研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性.将VP1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性.目的蛋白经纯化后用ELISA分析其与猪疫苗血清的免疫反应性,结果显示该重组VP1蛋白(rVP1)只能与部分O型FMDV疫苗血清反应.推测当前使用的不同O型FMDV疫苗毒株在VP1重要中和抗原位点G-H环(134 aa～158 aa)与C末端(200 aa～213 aa)存在较大差异.     

猪博卡病毒VP1蛋白抗原表位分析及其克隆表达

为研究猪博卡病毒(PBo V)VP1蛋白在血清学诊断中的作用,用DNAStar软件预测了PBo V NP08株(Gen Bank登录号KR014255.1)VP1蛋白的主要抗原表位,确定1-334个氨基酸为优势抗原表位区,构建重组质粒p ET32a-VP1,将其转化感受态细胞BL21(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为56.7 ku的重组蛋白VP1,主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白的Western blot结果表明,表达的VP1蛋白与临床阳性血清具有良好的反应性。用该蛋白包被ELISA板,检测10份临床感染PBo V的猪血清样品和3份未感染猪的血清,结果表明其具有很好的特异性,不与未感染猪的血清发生反应,为建立PBo V感染血清学诊断方法奠定了基础。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

2株O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的核苷酸序列分析

口蹄疫(Food and mouth disease,FMD)是由小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物传染病,人也易感,对畜牧业危害极大。病原的变异性高,存在7种血清型(O,A,C,ASI-A1,SAT1-3)和多种亚型,群内各型同源性达60%~70%,但两群之间     

猪内源性反转录病毒囊膜蛋白基因的克隆及其蛋白二级结构和B细胞表位预测

猪内源性反转录病毒（PERV）是与猪-人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。env基因编码病毒的囊膜蛋白,它与病毒的亚型分类、宿主感染范围、细胞的嗜性以及对宿主细胞的感染机制、诱导宿主产生中和抗体等密切相关。本研究利用RT-PCR的方法,从五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV的囊膜蛋白基因并进行测序,随后用生物信息学相关软件和方法,对PERV-Env蛋白二级结构及B细胞表位进行预测。经综合分析评价,结果发现PERV-Env蛋白有18个可能的B细胞优势抗原表位区域,7个可能的糖基化位点。该分析预测结果不但有利于PERV疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制,而且将有助于分析Env蛋白的功能及PERV对人源细胞的感染机制。     

禽波氏杆菌外膜蛋白A的克隆测序与生物信息分析

本文旨在克隆禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA的编码基因,并预测OmpA蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA在免疫保护中所起的作用。作者对禽波氏杆菌的外膜蛋白ompA基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对禽波氏杆菌OmpA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。禽波氏杆菌ompA基因全长597bp,编码199个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和β-片层,少见β-转角;推测OmpA蛋白有5个B细胞优势抗原表位区域、2个糖基化位点。本研究为进一步分析禽波氏杆菌免疫机理、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定理论基础。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测

利用生物信息学预测绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)NM株囊膜蛋白优势抗原表位,为寻找用于绵羊肺腺瘤病诊断和预防的候选抗原表位提供参考。参照OPAV-NM株env基因序列(登录号:JQ837489),应用Gamier-Robson方法、SOPMA方法和网络服务器PSIPRED、Predictprotein预测OPAV-NM株囊膜蛋白的二级结构。用Kyte-Doolittle方法预测蛋白质的疏水区和亲水区,用Emini方法预测蛋白质表面可能性,以Jamson-Wolf方法预测蛋白的抗原指数,利用Bcepred、IEDB、ABCpred网络服务器预测囊膜蛋白的抗原性,然后综合评价囊膜蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,囊膜蛋白(ENV)二级结构丰富,α螺旋和β折叠所占比例相对较多,也具有多处转角及无规则卷曲区域,提示OPAV-NM囊膜蛋白具有较多的优势抗原表位区段。这些优势抗原表位分别为第52～76,101～110,118～165,182～196,201～215,281～305,309～332,335～356,461～476,530～574位氨基酸,其中第461～476位和第530～574位的部分氨基酸序列位于胞外区,且第530～574区段位于en-OPAV和ex-OPAV的囊膜氨基酸序列的差异区,该段氨基酸序列对绵羊肺腺瘤病毒疫苗和诊断方法的研究有重要意义。     

羊传染性脓疱病毒OVIFNR蛋白结构分析与B细胞表位预测

本研究应用生物信息学方法,预测分析羊传染性脓疱病毒(ORFV)的OVIFNR蛋白结构与B细胞抗原表位。从羊传染性脓疱病羊嘴唇结痂中扩增出ORFV的OVIFNR基因序列并进行测序鉴定,上传至NCBI;应用生物信息学软件,将扩增所得的OVIFNR基因序列和GenBank公布的参考序列,在核苷酸和氨基酸水平上进行同源性分析和遗传进化树构建,并对OVIFNR蛋白分子的理化特性、跨膜区、信号肽、亲疏水性、二级结构、三级结构和B细胞抗原表位进行预测分析。结果显示:所扩增序列与Hoping和Nantou毒株的OVIFNR基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.6%和100%;通过遗传进化树发现,所扩增序列的毒株与Hoping、ShanX、Nantou毒株处于同一分支;OVIFNR蛋白的理论等电点为4.83,半衰期为30 h,脂肪族指数77.92,总平均疏水性为–0.181,无跨膜区和信号肽,不属于跨膜蛋白;二级结构中α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲分别占68.64%、7.56%、15.13%、9.18%,筛选出了8个优势B细胞表位;OVIFNR蛋白为亲水性蛋白,含有较多B细胞表位,具有抗原性,可以作为ORFV检测的新靶点。本研究为OVIFNR蛋白的功能研究和ORFV检测方法的建立提供了理论依据。     

Determination of the Complete Genome of DHAV GX Strain and Bioinformatics Analysis of VP1 Protein

In order to investigate the genotypic characteristics and biological characteristics of major capsid protein (VP1) of duck hepatitis A virus (DHAV) GX strain, the whole genome of GX strain was sequenced and compared with 3 serotypes reference strains of DHAV by the molecular biology software.The results showed that the full-length genome of DHAV GX strain was 7 800 bp, including 5'UTR (652 bp), 3'UTR (369 bp) and ORF (6 756 bp) encoding 2 251 aa and its coding products were 12 (VP0/VP3/VP1/2A1/2A2/2A3/2B/2C/3A/3B/3C/3D) at least.Sequence analysis showed that DHAV GX strain could be ranked DHAV 3 style.This strain shared the highest homology with DHAV-3 reference strains; Furthermore, GX strain and DHAV-3 FS strain were in the same cluster, might come from the same ancestor.Amino acid segments locating in 195 to 201 and 211 to 221 aa could be larvaceous dominant B-cell linear epitopes.It suggested that VP1 gene could be used as a candidate gene for the development of genetic engineering vaccine of DHAV.     

鸭甲肝病毒GX株全基因组序列测定及VP1蛋白生物信息学分析

为探讨鸭甲肝病毒(DHAV)GX株基因分型特点及主要衣壳蛋白(VP1)的生物学特性,本试验对其进行全基因组序列测定,并应用分子生物学软件将DHAV GX株与DHAV 3个血清型参考毒株进行序列比对分析。结果显示,其基因组全长7 800 bp,由5'和3'非编码区(UTR)和一个大开放阅读框(ORF)组成。其中,5'UTR和3'UTR的长度分别为652和369 bp;ORF长度为6 756 bp,编码2 251个氨基酸长的多聚蛋白,其编码产物至少有12个(VP0/VP3/VP1/2A1/2A2/2A3/2B/2C/3A/3B/3C/3D);在分类地位上DHAV GX株属于DHAV-3,其与DHAV-3参考株核苷酸、氨基酸同源性最高;与DHAV-3 FS株亲缘关系最近,在同一较小分支上。DHAV GX株结构蛋白VP1以第195—201、211—221位氨基酸区段为B细胞优势表位的可能性较大。提示,VP1基因可作为研制DHAV基因工程疫苗的优势候选基因。     

狐貉源犬瘟热病毒F蛋白基因的二级结构及其B细胞抗原表位预测

以犬瘟热病毒基因组序列为材料,采用Garnier-Robson、Chou-Farsman和Karplus-Schultz方法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini方法预测了结构蛋白的表面可及性,以Jameson-Wolf方法预测了蛋白的抗原指数,综合评价了犬瘟热病毒F蛋白的B细胞抗原表位。结果表明:F蛋白N端含有抗原指数较高的区域,提示可能含有潜在的B细胞优势抗原表位。     

鹅细小病毒VP3蛋白B细胞线性表位的精确定位

本试验旨在利用获得的4株抗鹅细小病毒(GPV)VP3的单克隆抗体,进一步对GPV VP3 B细胞线性抗原表位精确定位。根据笔者实验室已鉴定的线性抗原表位区结果,筛选出单抗所针对的优势抗原表位区。设计并合成互相重叠5 aa的10 aa短肽寡聚核酸片段,退火后,连入pET-32a载体,经转化鉴定,诱导表达后,获得相应的小片段融合蛋白,并利用单抗通过Western blot进行抗原性鉴定。同样方法进行短肽片段两端氨基酸的逐个缺失设计,进一步精确定位,结果鉴定出2个抗原表位,分别为430-435 aa和643-647 aa。     

禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白二级结构及其细胞抗原表位预测

研究旨在运用DNAStar生物软件及Garnier-Robson、Chou-Fasman等方法分析禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）标准毒株S1133重要结构蛋白σB和σC的二级结构及其T细胞和B细胞抗原表位。通过分析其亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数等特性,对σB和σC蛋白的B细胞抗原表位进行预测;以Rothbard-Taylor和AMPHI方法预测σB和σC蛋白的T细胞抗原表位。结果显示,σB和σC蛋白形成α-螺旋结构的能力较差,但与σB蛋白相比,σC蛋白含有较多的β-折叠结构、转角及无规则卷曲等二级结构,因而σC蛋白二级结构较复杂。分析结果还表明σB和σC蛋白均含有潜在B细胞和T细胞抗原表位,尤其是σC蛋白具有较多的B细胞和T细胞抗原表位。本试验为深入研究σB和σC蛋白的免疫学特性及研发ARV新型疫苗和药物靶标奠定基础。