利用CMV启动子构建PRRSV感染性克隆的研究

【目的】建立一种利用CMV启动子获得拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒提供操作平台。【方法】根据PRRSV的基因序列特征和CMV启动子的序列特征,对pBluescprictⅡSK(+)载体进行多克隆序列改造;设计特异性引物,分6段扩增、组装出PRRSV的全长cDNA并扩增CMV真核启动子序列;采用酶切、连接、转化等方法将连接成功病毒的全长cDNA置于CMV真核启动子序列的下游,获得含有CMV启动子和猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株全长cDNA克隆的重组质粒pSK-CH-1A;再将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞,得到猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株病毒的拯救病毒。【结果】成功获得了19 112bp含CH-1A全长cDNA的pSK-CH-1A载体,将其直接转染MARC-145宿主细胞后,经细胞体内转录合成病毒基因组RNA,获得了拯救病毒(rCH-1A);病毒生长特性试验结果显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性,且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记MluⅠ酶切位点。【结论】建立了一种方法简单,操作方便,节约时间和成本的PRRSV感染性cDNA克隆的体外拯救方法。     

猪蓝耳病的流行现状和控制对策

猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒所致的一种病毒性传染病，以妊娠母猪的繁殖障碍及各种年龄，特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株感染性分子克隆的构建

 【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）拯救平台，为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDV Gt株全基因组中引入分子标签（A节段：EcoR V酶切位点；B节段：PstI酶切位点）。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构（HamRz）和丁肝病毒核酶结构（HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，LipofectamineTM2000介导共转染DFI细胞，进行病毒拯救研究。 【结果】 构建的IBDV感染性克隆可在DFI、Vero/E6、Vero/P12等3种细胞上高效拯救出病毒。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE，且TCID50与亲本毒差异不显著，具有相似的生物学特征。【结论】构建的RNA聚合酶ⅢBDV拯救系统高效、稳定、简便、经济，且具有良好的细胞普适性。     

3种亚群PCV-2感染性克隆的构建及体内外感染性

通过PCR扩增出猪圆环病毒2(PCV-2)3个亚群(1A、1B、1C)毒株的全基因组DNA序列,并分别克隆入pMD-18T载体,获得含有PCV-2全基因组的3个重组质粒,分别命名为RP8(1A)、P0(1B)和P4-1(1C).将3个重组质粒分别用SacⅡ切出1767 bp的PCV-2全基因组,并在体外分别用T4连接酶连接而环化.用脂质体将3种自身环化的基因组转染无PCV-1污染的PK-15细胞,并按常规病毒培养方法分别传代,第5代细胞培养物分别用间接免疫荧光试验(IFA)及PCR方法检测转染的细胞,检测结果均为阳性,说明已获得PCV-2共3个亚群1A、1B、1C的感染性克隆.用1A、1B、1C感染性克隆的第5代细胞培养物分别接种小鼠,可在接种小鼠的血液中分别检测到相应PCV-2亚型的基因组DNA,表明本试验构建的自身环化的1A、1B、1C亚型的PCV-2的全基因组DNA在体内、体外均具有感染性.     

鸡贫血病毒安徽分离株感染性克隆的构建及其感染特性

鸡贫血病毒（chicken anemia virus,CAV）是诱导雏鸡发生免疫抑制的重要病原之一。应用PCR方法从安徽某鸡场送检病鸡肝组织中检测并鉴定CAV,扩增病毒全基因组序列插入pcDNA3.1(+)载体,并引入含Kpn I （GGTACCCAG）酶切位点的9 bp外源性标签,获得顺次连接的双拷贝CAV基因组的重组质粒,通过脂质体介导转染鸡MDCC-MSB1淋巴细胞并拯救出CAV感染性克隆毒株。经动物试验,感染性克隆毒株在接种1日龄健康雏鸡后15 d,对胸腺等免疫器官指数影响较小,胸腺病变不明显,表明其感染能力减弱,为进一步分析CAV致病机制和筛选疫苗候选株奠定基础。     

三种亚群PCV-2感染性克隆的构建及体内外感染性试验

本研究通过PCR扩增出猪圆环病毒2(PCV-2)三个亚群（1A、1B、1C）毒株的全基因组DNA序列,并分别克隆入pMD-18T载体,获得含有PCV-2全基因组的3个重组质粒,分别命名为RP8（1A)、P0（1B）和P4-1（1C)。将3个重组质粒分别用SacⅡ切出l767bp的PCV-2全基因组,并在体外分别用T4连接酶连接而环化。用脂质体将3种自身环化的基因组转染无PCV-1污染的PK-15细胞,并按常规病毒培养方法分别传代,第5代细胞培养物分别用间接免疫荧光实验(IFA)及PCR方法检测转染的细胞,检测结果均为阳性,说明已获得PCV-2三个亚群1A、1B、1C的感染性克隆,用1A、1B、1C的感染性克隆的第五代细胞培养物分别接种小鼠,可在接种小鼠的血液中分别检测到相应PCV-2亚型的基因组DNA。表明本试验构建的自身环化的1A、1B、1C 三种亚型的PCV-2的全基因组DNA在体内、外均具有感染性,为研究PCV-2的不同基因群毒株与毒力之间的关系打下了基础。     

中国马传染性贫血病毒驴强毒株感染性分子克隆的构建

 马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）驴强毒株DV是一株经过驴体传代获得的而具有超强毒力的毒株，对马和驴均可100％致死。用PCR方法分段扩增了DV其前病毒基因，将包含全基因片段的3个基因克隆以限制性内切酶消化后顺次连接克隆到pLG338上，命名为pD70344。将此克隆体外转染驴胎皮肤细胞和驴白细胞，连续盲传3代并以反转录酶活性测定，RT-PCR鉴定其病毒活性，透射电镜观察发现细胞培养物中存在大量典型病毒粒子，证明获得了1株具有感染性的EIAV病毒粒子，命名为pD70344V。经序列测定确认了本试验首次构建了1株完全来源于EIAV强毒基因的感染性分子克隆，将此克隆病毒接种驴，可以引起典型的马传贫症状并导致试验动物死亡。该分子克隆的建立为进一步考察病毒的毒力与基因的关系提供了良好的平台。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

以本实验室从河北分离到的TGEV毒株,采用RT-PCR技术扩增了TGEV N基因,长为1149bp,并进行亚克隆重组到pMD18-T质粒载体上,连接,转化,鉴定后得到阳性重组质粒．命名为pTN．将重组质粒插入的片段进行序列分析和比较,结果表明TGEV河北分离株N基因与国外的Purdue-115、FS772/70、TO14、96-1933株均具有较高的同源性,达95％以上。推导的氨基酸序列同源性为95％以上。并将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-3重组,成功构建了原核表达载体pGEX-N。pGEX-N表达载体的构建,为其蛋白质的表达提供重要依据。     

猪圆环病毒2型重组病毒ZJ-R感染性克隆的构建

利用无缝克隆方法构建ZJ-R全长基因组的单拷贝分子克隆以及双拷贝串联分子克隆;通过生物信息学技术预测ZJ-R病毒结构蛋白的B细胞抗原表位,人工合成选定的表位肽,然后偶联KLH免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;免疫组化试验证实该多抗与转染PK15细胞的ZJ-R双拷贝串联分子克隆具有反应性。结果表明构建的ZJ-R双拷贝串联分子克隆具有感染性。     

高致病性猪蓝耳病免疫失败的原因探讨

猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸障碍综合征”，是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，不同年龄、品种和性别的猪都能感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。1987年，该病在美国首次被发现，1996年我国在猪群中分离到蓝耳病病毒。     

塞内卡病毒GD05/2017株全基因组序列测定及其感染性克隆构建

为测定塞内卡病毒(SVA) GD05/2017株的全基因组序列,并构建其感染性克隆,根据GenBank公布的塞内卡病毒全基因序列设计引物,将分离的塞内卡病毒毒株GD05/2017全基因组划分为4个片段进行PCR扩增,并进行序列测定与分析。利用酶切连接和同源重组的方法,将基因片段依次克隆至pEGFP-C3载体中,构建该毒株的全长cDNA克隆pC3-SVA-GD05。将pC3-SVA-GD05转染BHK-21细胞,拯救病毒。结果表明:该毒株基因组全长7 251 bp,开放阅读框为6 543 bp,编码2 181个氨基酸, 5′和3′非编码区分别为650和58 bp。VP1核苷酸序列的遗传进化树分析表明,该毒株与China/HN16处于同一分支。将pC3-SVA-GD05转染BHK-21细胞, 72 h后收集细胞培养上清,然后将上清接种ST-R细胞,可观察到明显的细胞病变。拯救病毒的间接免疫荧光结果表明成功拯救出具有感染性的SVA。拯救病毒与亲本病毒的生长动力学曲线及空斑试验表明两者具有相似的复制能力和生长特性。这一研究构建了塞内卡病毒的感染性克隆并成功拯救出病毒,为深入研究SVA的致病机制及开发疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

 采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 ,为进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础     

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。     

猪蓝耳病的诊断与防治

猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸障碍综合征”．此病传播迅速．主要经呼吸道感染．主要侵害繁殖母猪和仔猪。病猪和带毒猪是本病的主要传染源。 猪蓝耳病病毒归属于动脉炎病毒科,动脉炎病毒属。根据病猪的严重程度和病程的不同,其临床表现也不同。     

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并用检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。     

正链RNA病毒感染性克隆的构建策略及影响因素

利用全长cDNA构建感染性克隆是拯救RNA病毒的基础和关键,也是反向遗传技术的核心。文章综述了构建正链RNA病毒感染性克隆的基本思路和关键技术,总结了影响克隆感染性的因素,并对感染性克隆技术的应用做一简述。     

夏季猪蓝耳病防治措施

猪蓝耳病是由蓝耳病病毒引起的,以繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)、呼吸道疾病(特别是仔猪)、皮肤及耳发蓝为特征,我国将其列为二类传染病。一、病原猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒     

猪高致病性蓝耳病及其预防措施

猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）即猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起的猪的一种接触性传染病,大约有50％的猪出现双耳发绀、青紫,故称“蓝耳病”。不同年龄、品种和性别的猪均能感染,但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感染;该病以母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征。     

杂合抗菌肽Cec Md-CheRc的分子设计及其克隆载体的构建

为了获得具有高抗菌活性和低溶血活性的抗菌肽,利用家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin,设计出杂合抗菌肽Cec Md-Che Rc,并构其克隆载体。选取Cec Md的N端和Chensirin的C端氨基酸序列组成杂合肽,通过互联网和计算机软件,分析比较杂合肽的特征参数并进行结构预测。采用重复序列PCR方法合成2条杂合肽Cec Md-Che Rc I和Cec Md-Che Rc IV的基因,并连接到克隆载体pMD18-T上。分析发现杂合抗菌肽中Cec Md-Che Rc I疏水性最强,Cec Md-Che Rc IV净正电荷数最高;两者N端为疏水性α螺旋结构,C端为亲水性α螺旋结构;两者疏水性氨基酸大体分布在螺旋轮的一侧,其余氨基酸分布在另一侧;带正电荷的氨基酸主要分布在亲水面上。2条杂合肽的基因大小分别为133 bp和124 bp;PCR、双酶切和测序鉴定表明成功地构建了克隆载体pMD18-T/Cec Md-Che Rc I和pMD18-T/Cec Md-Che Rc IV,为后续研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征的诊断技术与防制方法

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）又称“蓝耳病”,它是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起,以成年母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要症状的猪的主要传染病之一,临床上主要以怀孕母猪发生流产、早产、死胎和木乃伊等严重的繁殖障碍．仔猪的呼吸系统症状和断奶前死亡率增高,育成猪呼吸困难,发育迟缓,公猪性欲减退、精液品质下降等为特征的一种新型传染病。该病已被国际兽疫局（OIE）列为法定报告的B类传染病,中国也将其列为二类传染病．是危害养猪业最严重的病毒性疾病之一,已给各地养猪业的发展造成了严重的经济损失。