F48E9株新城疫病毒F和HN蛋白在Vero细胞的表达

将新城疫病毒（NDV）F48E9株的F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,筛选出含有F和HN基因的重组质粒,命名为pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化的质粒转染Vero细胞后,经间接免疫荧光试验检测到蛋白的表达。pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒共转染Vero细胞后,观察到明显的细胞融合现象。结果表明NDV F48E9株的F和HN蛋白在真核细胞内得到了真实的表达,并且表达产物具有天然蛋白活性。     

新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达

为构建杆状病毒转移载体，通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的StuⅠ位点和NP基因上的XbaⅠ位点进行突变，扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAeAB4上，F基因和M基因均在p10启动子的操控之下，NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游，构建重组杆状病毒转移载体pAeAB4-F-NP-M-HN。pAeAB4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rBae-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞，72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示：M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达，大小与预期结果一致；感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒，并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。     

麻鸡新城疫病毒SX-1株F和HN基因共表达蛋白的免疫原性

用PCR扩增麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因,并以由15个氨基酸构成的短肽为Linker将F及HN基因片段体外连接,与转座载体PFastBacⅠ连接,获得重组质粒PFastBacF—HN,并转化到DH10Bac宿主菌,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得的重组Bacmid F—HN质粒转染Sf-9昆虫细胞,进行表达检测,表达产物间接免疫荧光试验阳性,经SDS—PAGE、Western-blot检测显示,获得相对分子质量约123000的蛋白特异条带,说明F-HN重组蛋白表达成功。将共表达蛋白进行进行动物试验,间接血凝试验表明雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,共表达蛋白二次免疫雏鸡后,对NDV强毒的攻毒保护率为80％,这一结果提示利用FHN基因构建的亚单位疫苗具有重要的开发应用价值。     

新城疫病毒F48E9株M和NP基因的原核表达

根据新城疫病毒（NDV）F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a（＋）上,转化E．coliBL21（DE3）,筛选表达NDVF48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDVM蛋白在E．coliBL21（DE3）内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDVM和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点，经过酶切、测序分析，筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒，分别命名为pCAGG—gB、pCAGG—gC、pCAGG—gD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化，将纯化后的质粒转染293T细胞，用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明，目的蛋白得到了真实的表达。     

新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析

根据NDV NP蛋白已知基因序列设计合成了一对引物，利用RT-PCR扩增出了F48E9株NP基因1598bp的片段，将该片段克隆到pMD18-T Vector上，并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定，结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性，采用Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定，获得了F48E9株NP基因片段的基因序列，利用DNASIS分析软件，将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较，其核苷酸序列同源性为88.2%。至此，我们获得了F48E9株NP基因的全长克隆。     

麻鸡副黏病毒ZH-1株HN基因真核表达载体的构建及其免疫试验

应用RT-PCR方法从麻鸡副黏病毒ZH-1株中扩增HN基因并克隆人pGEM-T载体,经序列测定、分析,结果显示ZH-1株HN基因与NDV国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到92％.将HN基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-HN,转染Vero细胞,能在Vero细胞中表达,利用pCI-HN质粒进行动物试验,结果表明,雏鸡免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,pCI-HN质粒二次免疫雏鸡后,对NDV强毒的攻毒保护率为67％,这一结果提示,利用HN基因构建的核酸疫苗具有重要的开发应用价值.     

NDV F48E9株HN基因的克隆、表达及其重组蛋白的抗原性研究

从新城疫标准强毒株F48E9株克隆血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,将HN基因转入昆虫杆状表达系统,转染昆虫细胞Sf9。经Western blot和间接免疫荧光鉴定,该系统成功表达了HN蛋白。重组HN蛋白单次免疫SPF鸡可诱导机体产生较高的抗体水平,为试验鸡提供较好的免疫保护。研究结果用于生产证明该重组HN蛋白可刺激机体产生较强的免疫反应,可用于生产有效的新城疫疫苗。     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

猪流感病毒NP基因重组复制缺陷型腺病毒的构建与表达

以含有猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)NP基因的重组质粒pMD18-NP为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增NP基因,将其亚克隆至质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有NP及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-NP-EGFP。利用脂质体转染法将穿梭质粒pDC315-NP-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选到重组腺病毒rAd-NP-EGFP。经PCR和Western blotting鉴定,结果表明NP基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物学活性。重组腺病毒rAd-NP-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.26×1010/mL,为进一步研究该重组病毒的免疫原性奠定了基础。     

猪源新城疫病毒F和HN基因的表达及其对BHK-21细胞膜的融合作用

为了分析猪源新城疫病毒F和HN基因对BHK-21细胞膜的融合作用,采用RT-PCR方法从猪源新城疫病毒JL01株中扩增获得了F蛋白基因,并根据GenBank上登录的猪源新城疫病毒HN基因序列,合成了HN基因,分别将F和HN基因克隆到pKS载体上。又从大肠杆菌BL21（DE3）中扩增得到T7RNA聚合酶基因,将报告基因EGFP与T7RNA聚合酶基因一起定向克隆到痘苗病毒转移载体pSTK上。再将pKS-F、pKS-HN与pSTK-T7-EGFP共转染BHK-21细胞,转染后16h,用Giemsa染液进行染色,可见明显的细胞融合现象。该研究证明猪源新城疫病毒JL01株的F和HN蛋白共同作用于BHK-21细胞使细胞膜融合。     

犬瘟热病毒小熊猫株H、F和N基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒（CDV）的核苷酸序列，设计并合成了扩增CDVH、F和N基因的3对引物，经RT—PCR分别扩增获得了CDV小熊猫株（LP株）H、F和N基因，并对H、F及N基因进行了克隆和序列测定。序列分析表明，CDV LP株属于强毒谱系，与CDV流行株的亲缘关系近．H基因含有较多潜在的糖基化位点．F和N基因相对比较保守。将CDV LP株H、F和N基因克隆入真核表达栽体pVAX1的CMV启动子下游，构建了CDV基因疫苗表达载体pVAXLPH、pVAXLPF、pVAXLPN，体外转染BHK-21细胞．用间接ELISA方法检测到目的蛋白的表达。用构建的3个表达质粒免疫小鼠，从小鼠血清中检测到了抗CDV抗体．初步证实用CDVH、F和N基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答。     

新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因的克隆及其酶切分析

根据已发表的新城疫病毒（ＮＤＶ）核衣壳蛋白（ＮＰ）基因序列,设计合成１对长度为３２ｍｅｒ的引物。ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＮＤＶＦ４８Ｅ８株、Ｕｌｓｔｅｒ株、ＬａＳｏｔａ株的ＮＰ基因,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均呈现１条长１．５ｋｂ左右的特异性带。将Ｆ４８Ｅ８株扩增产物克隆入ｐＵＣ１８载体,经限制性内切酶分析证实为ＮＰ基因。     

NDV长春株和四平株HN/F核酸疫苗的构建及表达

将新城疫病毒（NDV）长春株和四平株HN插入pIRES1多克隆位点（EcoRⅤ）中，构建成核酸表达疫苗pIRcHN和pIRsHN，然后切除pIRcHN和pIRsHN的新霉素基因，将长春株和四平株F基因分辊手稿其中，构建成pIRcHNF和pIRsHNF，而后分别转染Hela细胞。经血凝效价测定、Western blot分析，弱毒株构建疫苗的血凝活性比强毒株高1个数量级，Hela细胞表达的HN蛋白量以pIRcHN最高，pIRsHN次之，pIRcHNF和pIRsHNF较低。将重组疫苗转染Hela细胞，用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验，结果，在细胞膜和细胞浆中观察到了特异性的黄绿色荧光，证明表达产物具有特异性。     

抗新城疫病毒HN蛋白单抗可变区基因的克隆与序列分析

提取抗新城疫HN蛋白单克隆抗体C3-B7杂交瘤细胞总RNA,进行RT-PCR,扩增出轻重链可变区基因。凝胶回收纯化后与pMD-18T载体连接,重组载体转化于宿主菌DH5α,筛选出阳性重组子,菌液PCR鉴定后进行测序。结果显示,VH基因全长357 bp,编码119个氨基酸;VL基因全长332 bp,编码110个氨基酸。这为单链抗体的构建及表达奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5和ORF6在真核细胞中表达

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基因的重组质粒,分别命名为pCAGGS-ORF3、pCAGGS- ORF5、DCAGGS-ORF6。将重组质粒纯化后转染293T细胞,用RT-PCR扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光检测,结果在胞浆内有亮绿色荧光,而在细胞膜上没有见到荧光,这说明表达的蛋白在胞浆内而不在细胞膜上。通过Westerm blot检测确定表达的GP3、GP5和M蛋白的分子量分别为42 Ku、25 Ku和19 Ku。本试验结果为进一步研究PRRSV膜蛋白伪病毒粒子及DNA疫苗奠定了基础。     

Immune responses induced by DNA vaccines encoding Newcastle virus haemagglutinin and/or fusion proteins in maternal antibody-positive commercial broiler chicken

1. The immune responses induced by recombinant plasmids containing Newcastle disease virus (NDV) F (pVAX.nd.f) or HN (pcDNA.nd.hn) genes separately or in combination in bi-cistronic (pIRES.nd.hn.f) constructs were evaluated in maternal antibody-positive commercial chicks. 2. Immunofluorescence and immunoperoxidase tests demonstrated the expression of both F and HN proteins in Vero cells. Real-time PCR analysis revealed the expression of HN and/or F genes in muscle, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), spleen and liver after immunisation. 3. Chicks inoculated intramuscularly thrice (two booster doses) with pVAX.nd.f and pcDNA.nd.hn did not develop detectable haemagglutination inhibiting (HI) antibodies. In contrast, an increase in a NDV-specific cell-mediated immune response was demonstrated. 4. After challenge with virulent NDV, chicks immunised with the recombinant plasmids as well as those in control groups succumbed to Newcastle disease. 5. Based on these results, it is concluded that DNA vaccines containing HN and/or F genes fail to protect commercial chicks, possibly due to interference from maternal antibodies.     

两株猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计一对引物,从分离的PCV-2 GZ株、HN株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2,并对其测序.结果表明,所克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2基因核苷酸序列同源性在90.6%～99.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在88.9%～98.7%之间.