陕西省小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS区序列与RFLP分析

 采用线虫通用引物TW81和AB28对采自陕西的20个小麦禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行PCR扩增、克隆和测序。利用Mega软件的UPGMA方法分析了陕西省小麦禾谷孢囊线虫群体及其与GenBank公布的近缘种的系统发育关系,结果表明陕西省小麦孢囊线虫群体的rDNA-ITS区片段的长度为1 045 bp,且均为禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）,ITS区序列同源性为99.56%,只有3处碱基存在差异。其ITS区同中国河南（EU106175）、北京（AY148382）、山东（HM370427）的禾谷孢囊线虫H. avenae,澳大利亚的H. australis（AY148395）及俄罗斯的H. pratensis（AY148351）的亲缘关系最为接近。利用8种限制性内切酶Ava Ⅰ（Eco88 Ⅰ）、Alu Ⅰ、Hha Ⅰ（Cfo Ⅰ）、Hae Ⅲ（BsuR Ⅰ）、Hind Ⅲ、Hinf Ⅰ、Rsa Ⅰ和Mva Ⅰ（Bst N1）对20个陕西省CCN群体的ITS区PCR扩增产物进行限制性内切酶谱（RFLP）分析,结果表明8种限制性内切酶酶切ITS-PCR产物后共产生22个酶切片段,20个种群的PCR-RFLP谱型一致,表明陕西省小麦禾谷孢囊线虫是同一个群体且与已报道的中国CCN群体的“C”型一致,有别于欧洲的“A”型群体和印度的“B”型群体。这是首次报道陕西省小麦禾谷孢囊线虫种群的分子特征。     

华中地区小麦禾谷孢囊线虫分布特点

在湖北省２８县（市）河南省密县，湖南省临湘县和华容县调查小麦禾谷孢囊线虫（ＣＣＮ）的分布特点，结果表明；河南省６个乡镇３５份样本中均值ＣＣＮ孢囊，湖北省多数标本中发现ＣＣＮ，在鄂中及偏东的平原地区，土壤肥活，绝对最低温度达到－１０℃以下的地方，ＣＣＮ分析频率和居群密度较大，同一地区同一类别土壤，ＣＣＮ多分布于５～３０ｃｍ土层中。     

小麦禾谷孢囊线虫湖北群体活动期特性

小麦播种时定量接种禾谷孢囊线虫（ＣＣＮ）（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａａｖｅｎａｅ）的孢囊,发芽生根后进行系统观察,结果表明,该线虫在小麦生长季节中完成１代,小麦播种后２５～３５ｄ是２龄幼虫入侵幼根的高峰期,１００～１２０ｄ根内出现３龄幼虫,１１０～１３０ｄ发育成４龄幼虫,１３０～１５０ｄ根表露出白色孢囊（雌虫）。受感染的麦根,侵染点首先变褐,进而肿大,常见分叉增多,形成须根团,ＣＣＮ多居于自然含磷,钾元     

内蒙古中西部地区小麦禾谷孢囊线虫的发生分布

2005—2008年调查了内蒙古中西部地区7个盟市的20个春小麦种植区,共采集分离并鉴定了255份根际土壤和根系。调查结果表明,禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae Woll.）在呼和浩特市、乌兰察布市、包头市、巴彦淖尔市、鄂尔多斯市、锡林郭勒盟等地区都有分布。其中,在乌兰察布市的察哈尔中旗、呼和浩特市的内蒙古农科院和内蒙古农业大学农场禾谷孢囊线虫虫口密度最大,每250 g土壤的孢囊平均含量分别达到了38.4、29.4个和16.4个。     

我国小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae Wollenweber)鉴定研究

 1989-1990年对湖北省天门县、潜江县、仙桃市、新洲县,河北、河南、山西等省及北京市郊等地的矮黄麦株根、根围田土的直接检查和漂浮分离检查,都查到褐或黑褐孢囊,内有大量可育卵,经用光学显微镜和扫描电镜对孢囊阴门锥膜孔特征,二龄幼虫头部细微结构等的观察及对其有关体值的测量,鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae Wollenweber 1924,后有名Bidera avenae(Wollenweber,1924)Krall & Krall,1978)亦即燕麦孢囊线虫。其主要形态特征为孢囊较大,阔柠檬形,色深褐,长709(601-903)μm,宽523(436-612)μm,阴门锥顶为典型双膜孔型,无下桥,阴门锥下方有许多排列不规则的泡状突;二龄幼虫长550(477-602)μm,头骨架发达,口针长24μm,唇盘伸长与亚背唇和亚腹唇融合形成一近肾形唇区结构。禾谷孢囊线虫是世界性重要病原线虫,已在32个产麦国家被发现,本研究在我国小麦上初次发现,为我国孢囊线虫一新记录种;明确了我国南北两类型麦区一些小麦矮黄不长、根系分叉多,细而乱,甚至纠结成团,开花前后,根侧露出微小如粉末的发亮颗粒状物(孢囊),产量往往骤减,即系其危害所致;从而纠正了以前多归因于施肥不匀、生理失常的错误认识;对进一步正确诊断、调查、研究其在我国的发生分布、危害规律、生物学特性及控制方法具有理论意义和实用价值。     

河北省小麦主产区禾谷孢囊线虫群体致病型研究

为了明确河北省小麦主产区禾谷孢囊线虫的致病类型,采用27个国际鉴别寄主品种和2个感病小麦品种‘石新733’和‘温麦4’对河北省邯郸、保定、任丘和唐山的4个禾谷孢囊线虫群体致病型进行了鉴定。依据Andersen等鉴别标准,4个群体的致病型不同于国际上已命名的16个禾谷孢囊线虫致病型。唐山群体为一个致病型,它的致病型和山西太谷、安徽固镇群体的致病型相似;邯郸群体、保定群体和任丘群体的致病型属于同一致病型,这3个群体的致病型和定州群体的致病型很接近。对照小麦品种‘石新733’和‘温麦4’对4个禾谷孢囊线虫群体均表现感病。     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及HS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质.利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28S rDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析.结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780 bp,rDNA-ITS片段长度约为1 040 bp.7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近.RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异.甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体.这是首次报道甘肃CCN种群分子特征.     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及ITS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质。利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28SrDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析。结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780bp,rDNA-ITS片段长度约为1040bp。7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近。RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异。甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体。这是首次报道甘肃CCN种群分子特征。     

北京地区小麦禾谷孢囊线虫病发生动态调查

小麦禾谷孢囊线虫病是小麦生产上的重要病害.2010-2011年对北京地区小麦禾谷孢囊线虫的发生规律进行了定期定点调查.结果表明,禾谷孢囊线虫在北京地区全年只发生1代,夏季滞育,卵孵化高峰为4月初;2龄幼虫侵染高峰为4月上旬,3龄幼虫发育高峰为4月下旬至5月初,4龄幼虫发育高峰为5月上旬,白雌虫发育高峰为5月下旬至6月上旬,10月份播种后部分2龄幼虫就可以发生侵染并且冬前发育至3龄幼虫.本研究结果可为北京地区禾谷孢囊线虫的防治提供理论依据.     

新型种衣剂防治小麦禾谷孢囊线虫病研究

在田间条件下研究了甘农种衣剂Ⅰ号、甘农种衣剂Ⅱ号、甘农种衣剂Ⅲ号、阿维菌素种衣剂AV1、阿维菌素种衣剂AV2和5.7%甲维盐等6个种衣剂对小麦孢囊线虫病的防治效果。播种前对麦种进行8个不同种衣剂包衣处理,比较小麦收获后土壤中孢囊数量的变化以及小麦增产情况。结果表明,不同种衣剂处理对土壤中孢囊线虫的繁殖均有一定抑制作用,其中甘农种衣剂Ⅲ号(1∶35)、甘农种衣剂Ⅰ号(1∶50)和甘农种衣剂Ⅱ号(1∶35)孢囊减退率分别为56%、53%和47%。不同种衣剂处理的小麦产量增加,甘农种衣剂Ⅲ号(1∶35)、甘农种衣剂Ⅰ号（1∶50）、甘农种衣剂Ⅱ号（1∶35）和甘农种衣剂Ⅰ号（1∶35）增产率分别为37.6%、19.4%、17.9%和17.7%。本项目中自主研发的甘农种衣剂Ⅲ号防治效果最显著,不仅对小麦孢囊线虫病具有较好的防效,而且具有安全、低毒、省工、经济的特点,可在农业生产实践中进行推广应用。     

河南郑州小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因ITS序列和RFLP分析

 采用PCR技术对河南郑州禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因(ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)进行扩增,获得片段长度约为1040bp。利用UPGMA方法分析了河南郑州禾谷孢囊线虫群体与近缘种的系统发育关系,结果表明:中国Heterodera avenae群体,H.australis和H.pratensis亲缘关系很近。8种限制性内切酶(Restriction Enzyme,RE)酶切禾谷孢囊线虫ITS的扩增产物,其中HindⅢ、AvaⅠ不能酶切PCR产物;Alu Ⅰ酶切PCR产物,获得560bp和480bp2个片段;RsaⅠ和Hinf Ⅱ酶切后分别得到3个片段(700、320、20bp和820、180、40bp);CfoⅠ是3个酶切位点(740、150、110、40bp);HaeⅢ和MvaⅠ能分别清晰地观察到3个片段(420、350、180bp和400、340、280bp),但有微小片段无法清晰观察到。9个种群所得RFLP图谱一致,说明郑州禾谷孢囊线虫群体可能是同一种群且不同于欧洲群体(typeA)和印度群体(typeB)的C型。     

江苏省小麦孢囊线虫病发生情况初步调查

2009年5月对江苏省5个地区的22个县市小麦孢囊线虫病发生情况进行了初步调查,共采集76份含根系和根际土壤的样本,经分离与鉴定表明,小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae,CCN)在徐州、连云港、宿迁和盐城等地区都有分布,检出率为35%。徐州的沛县、丰县、邳州和睢宁等4个县市的小麦孢囊线虫病检出率超过90%。其中,丰县华山镇、沛县河口镇和丰县城东的田块孢囊密度较大,每100 mL土壤的平均孢囊数分别为161、159个和112个,每个孢囊的平均含卵量分别为187、190粒和174粒。这是小麦孢囊线虫病在江苏省发生的首次报道。     

豫北及冀南地区4个小麦禾谷孢囊线虫群体的种类鉴定

禾谷孢囊线虫病(Cereal Cyst Nematode,CCN)是世界上为害小麦等禾谷类作物的重要根部线虫病害,许多国家受害严重[1].该病的病原禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae group)是一个复合种群组,包括12个有效种和几个未命名的种,其中发生普遍、危害严重的有燕麦孢囊线虫(H.avenae)、菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)、大麦孢囊线虫(H.hordecalis)和麦类孢囊线虫(H.latipons)[1].我国1987年在湖北省天门县首次在小麦上发现禾谷孢囊线虫病,Wang等[2]鉴定病原为燕麦孢囊线虫(H.avenae);后陆续在河南、安徽、山东等多个省份发现该病,病原均为该种线虫.2010年Li等[3]在河南许昌报道发现了菲利普孢囊线虫(H.filipjevi).     

青海、陕西部分地区禾谷孢囊线虫 rDNA-ITS-RFLP的特征分析

 采自我国青海、陕西等省地11个寄生小麦的孢囊线虫群体经形态学鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)。用PCR技术扩增获得的rDNA-ITS片段长度约为1 060 bp。用Hinf Ⅰ、Taq Ⅰ、Hpa Ⅱ、Hae Ⅲ、Pst Ⅰ、Alu Ⅰ 等6种限制性内切酶酶切ITS扩增产物;青海10群体YBT10A、HY65A、HY61B、ZHZ162B、HY5B、HHX8A、GH132A、HY92A、HY127B、DT142A 的6个酶的RFLP图谱完全一致;陕西YL4A群体的Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ和Hpa Ⅱ酶切结果与青海群体的上述3种酶切结果相同,但Alu Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切结果比青海孢囊线虫群体都多1条1 060 bp片段,而YL4A群体Taq Ⅰ酶切结果较为复杂。对比已知Avenae组成员RFLP图谱,青海群体与北京房山H.avenae群体的RFLP图谱一致;而陕西YL4A的Alu Ⅰ图谱与H.avenae法国群体一致,Pst Ⅰ和Taq Ⅰ却与Avenae组成员已知酶切结果均不一致。河南3个禾谷孢囊线虫群体除Taq Ⅰ酶切结果比青海CCN群体多1条520 bp片段以外,其他5种酶的RFLP都一致,而与澳大利亚的禾谷孢囊线虫H.avenae群体的RFLP图谱一致。     

燕麦孢囊线虫对山东地区小麦产量的影响

为评估燕麦孢囊线虫Heterodera avenae发生对小麦产量损失的影响,采用室内盆栽和田间试验相结合的方法,测定了燕麦孢囊线虫不同初始接种密度下对山东省小麦主栽品种的为害损失。结果表明：盆栽条件下,燕麦孢囊线虫为害小麦,影响小麦农艺性状,每克土壤中初始接种卵量为5~30个时,小麦叶绿素含量、根干重、茎干重、有效分蘖数、穗粒数、千粒重、穗重与未接种线虫处理的小麦相比分别降低了10.89%~34.46%、30.65%~73.95%、13.93%~58.68%、30.48%~53.33%、3.97%~36.93%、-3.73%~1.28%、-0.72%~35.08%;而在田间肥水充足条件下,燕麦孢囊线虫对小麦的各项产量指标无显著影响;繁殖系数与线虫初始密度呈负相关。试验表明,燕麦孢囊线虫发生对小麦产量存在潜在威胁,在制定防治措施时,应充分考虑水肥条件,重视对中低产田的影响。     

河北省小麦孢囊线虫病的发生与分布

于2009-2011年对河北省10个地区55个县的小麦孢囊线虫发生情况进行系统调查,共采集土样719份.调查结果表明:孢囊总检出率为52.7％,其中冬麦区孢囊的检出率为61.2％,春麦区孢囊检出率为0.石家庄地区孢囊检出率最高,达90％,各地区孢囊检出率大小顺序依次为:石家庄、邢台、保定、邯郸、廊坊、衡水、唐山、沧州、张家口、承德.其中唐山滦南县与任丘市孢囊线虫发生最为严重,分别有11.8％和7.7％地块每100mL土中的孢囊数量在40个以上.沙壤土中孢囊线虫的检出率最高,达63.0％,壤土与黏土中小麦孢囊线虫的检出率分别为60％和50％,在沙土地块未发现小麦孢囊线虫.依据孢囊线虫的形态特征,河北危害小麦的孢囊线虫种类应为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae).     

甘肃省大麦条纹病病原菌致病力分化、rDNA-ITS及遗传多样性分析

为明确甘肃省大麦条纹病病原菌麦类核腔菌Pyrenophora garminea的致病力分化、r DNA-ITS序列特征及变异,采用"三明治"法测定甘肃省大麦条纹菌的致病力,通过r DNA-ITS序列分析菌株间变异类型,并对菌株进行ISSR遗传多样性分析。结果表明,共筛选到43株大麦条纹病菌,生长7 d后的菌落直径为2.60~7.93 cm,其中菌株TB生长速度最快,菌株JT生长速度最慢,强、中等和弱致病力菌株分别为2、21和20株;43株菌的核糖体DNA-ITS序列与麦类核腔菌菌株SMCD2015同源性在99%以上;在9个菌株中检测到15个变异位点,共17种变异类型;8个ISSR标记从43个菌株中扩增出41条带,平均每个标记5.13条带,90.24%片段具有多态性,遗传相似系数为0.44~1.00,平均值为0.71,当遗传相似系数为0.68时,可将供试菌株划分为4个类群。表明甘肃省大麦条纹病病原菌存在致病力分化,菌株核糖体DNA-ITS序列变异丰富,且菌株间遗传结构复杂。     

我国玉米灰斑病菌遗传多样性的ISSR分析

为明确我国发生的玉米灰斑病菌地理差异及遗传结构,利用简单序列重复区间(ISSR)对玉米灰斑病菌遗传多样性进行了分析,并利用尾孢菌特异引物对分离自四川、云南、湖北、贵州等西南地区的16个玉米灰斑病菌菌株进行了分子鉴定。结果显示,通过ISSR标记筛选出10个扩增多态性好且稳定的通用引物,共扩增出81条DNA条带,均为多态性条带,扩增片段大小在200~2 000 bp之间,菌株遗传相似系数为0.19~1.00。在遗传相似系数为0.19时,供试菌株被聚为2大类群,来自西南地区和东北地区的菌株各自聚为一组,在DNA水平上表现出明显差异,认为是2类不同的致病类群。分子鉴定结果显示引起西南各地区玉米灰斑病的主要致病菌均为玉米尾孢菌Cercospora zeina。表明我国玉米灰斑病菌存在丰富的遗传多样性,ISSR标记可揭示出玉米灰斑病菌株间的亲缘关系及遗传差异性,可用于其遗传多样性研究。     

20份美国冬小麦品种的遗传多样性分析

为了解从美国引进的20个冬小麦品种的遗传差异及其遗传丰富度,提高其作为小麦种质资源的有效利用率,选择了具有多态性的24对SSR标记进行检测。结果表明:48条引物在20个冬小麦品种中检测到153条差异带,每对引物多态性位点2~13个,平均6.37个,可以清楚地将供试品种分开;20个材料的遗传相似系数为0.62~0.84,平均遗传相似系数为0.72,供试品种的遗传基础有一定的差异性,其中相似系数最高的是1R2与1R24,为0.84。聚类分析在相似系数0.68处将20个品种聚为四类。