人脐静脉内皮细胞培养对高分子生物活性材料的筛选

脐静脉内皮细胞由新鲜脐带红胰蛋白酶对脐静脉的消化获得，并在体外进行组织培养获得成功．应用脐静脉内皮细胞培养技术对不同高分子生物活性材料进行了筛选，发现结果稳定，并具有材料之间的可比性．本法不失为一种筛选生物活材料的有效方法     

猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究

为了建立稳定的血管内皮细胞系,进而为研究猪瘟病毒致病机理提供理想的细胞模型,将脂质体转染的pCIneo-hTERT质粒导入原代猪脐静脉血管内皮细胞中,经G418抗性筛选,挑取阳性克隆并扩大培养。对转染后的细胞进行形态观察,研究其增殖及生长特征,并对其端粒酶活性进行了鉴定。结果表明,转染细胞单层贴壁生长,有接触抑制性,呈铺路石状;F-ⅧAg和CD34免疫荧光鉴定阳性,具有转染前细胞特征;转染后细胞培养代数增加,传至第10代和15代转染后细胞端粒酶活性检测为阳性。说明hTERT转染可以延长猪血管内皮细胞的寿命。     

经猪血管内皮细胞多次传代的CSFV E2基因的遗传变异研究

【目的】研究猪瘟病毒(CSFV)E2基因在猪脐静脉血管内皮细胞中多次传代后的遗传变异情况,为CSFV的致病机理研究提供理论依据。【方法】分离并培养猪脐静脉血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株脾毒后继续培养,染毒细胞经3次连续传代后全部死亡、脱落,收集每代细胞并提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增CSFVE2基因。将获得的目的基因克隆入T载体并转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒,进行PCR和BamHⅠ、HindⅢ酶切鉴定,将阳性的重组质粒进行测序,并用DNAStar软件进行序列分析。【结果】扩增出了E2基因,重组质粒PMD18-T-E2的PCR和双酶切鉴定结果表明,E2基因与pMD18-T载体连接成功。各代猪脐静脉血管内皮细胞中CSFVE2基因之间的核苷酸序列同源性为99.4%~99.9%,氨基酸序列同源性为98.9%~99.8%;各代猪脐静脉血管内皮细胞中的CSFVE2基因与标准病毒石门株之间的核苷酸序列同源性为98.9%~99.3%,氨基酸序列同源性为98.9%~99.2%。【结论】猪瘟病毒石门株在猪血管内皮细胞上传代的过程中E2基因无明显的变异,能保持遗传的稳定性。     

TGF-β1诱导SUVEC向平滑肌样细胞转分化的初步研究

用不同浓度TGF-1β对猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)进行诱导,研究体外诱导SUVEC向平滑肌细胞分化的可能性。倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学SP法对细胞表面特异性标志物进行染色。结果表明,诱导后细胞失去内皮细胞典型的铺路石样形态,而呈现出肌成纤维样细胞;对诱导后的细胞进行免疫组化检测,发现5～10ng.mL-1 TGF-1β诱导后,平滑肌特异性蛋白-αSMA的相对表达量均显著升高;而浓度升高为20 ng.mL-1时,升高不显著;内皮细胞特异性标志(F-ⅧRAg)的表达均显著下降。该研究表明TGF-1β可诱导猪脐静脉血管内皮细胞向肌样细胞分化,但诱导分化的能力与TGF-1β的浓度有关。     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

猪脐静脉血管内皮细胞的分离与培养

采用1g/L胶原酶灌注猪脐静脉,消化分离内皮细胞并在适宜条件下培养。对培养细胞的生长特性进行检测,并对细胞进行第 因子相关抗原(F- RAg)和扫描电镜形态学鉴定。结果表明,70%细胞在24h内贴壁,第3～5天生长迅速,第4～5天长成单层。培养的细胞呈单层贴壁生长,典型铺路石状,第 因子相关抗原(F- RAg)检测阳性,证明培养的细胞为血管内皮细胞。     

人血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1胞外区cDNA在婴儿双歧杆菌中的表达和鉴定

目的：构建携带重组基因sFlt-1的婴儿双歧杆菌基因转运载体系统,并观察其对人脐静脉内皮细胞生长的影响。方法：将编码血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1胞外区1-3loop316个氨基酸残基的cDNA插入到pET32a构建了重组表达质粒pET32a-sFlt-1,转化入婴儿双歧杆菌,转化婴儿双歧杆菌,阳性克隆菌经质粒提取、酶切鉴定。结果：得到两条大小分别与基因sFlt-1及pET32a质粒片段大小相符的电泳条带,PCR检测到外源性sFlt-1基因已成功导入婴儿双歧杆菌,在体外实验中,重组质粒组人脐静脉内皮细胞形态出现明显改变,细胞生长受到明显抑制,而空质粒组细胞无明显变化。结论：成功构建携带重组基因sFlt-1的婴儿双歧杆菌基因转运载体系统。     

人VEGF受体Ⅱ胞外Ⅲ区单克隆抗体研制与生物学活性测定

根据GenBank中发表的血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Ⅱ(KDR)基因序列,设计1对引物经RT-PCR从人脐静脉内皮细胞中克隆出KDR胞外Ⅲ区(KDRD3)编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-6P1.重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃条件下诱导,经SDS-PAGE和Western blottin...     

稳定表达猪miRNA let-7c细胞株的建立及其对CSFV的调控作用

【目的】构建含有let-7c前体基因的重组质粒pGene-pre-let-7c,建立稳定表达猪miRNAlet-7c细胞株,研究let-7c对猪瘟病毒(CSFV)复制的调控作用。【方法】利用RNA22软件筛选出CSFV基因组3′-UTR潜在的let-7c结合位点,PCR扩增出let-7c前体片段,连接到表达载体pGenesil-1.1-dBm2上,构建重组质粒pGene-pre-let-7c,采用脂质体法将重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),经G418抗性压力筛选获得阳性细胞株。对获得的阳性细胞株进行接毒试验,检测CSFV的复制情况。用MTT比色法检测阳性细胞的增殖情况。【结果】成功扩增出let-7c前体基因,并构建了pGene-pre-let-7c重组质粒。重组质粒转染SUVEC细胞后筛选获得了稳定表达let-7c的细胞株。let-7c可下调CSFV在细胞中的复制。【结论】let-7c可下调CSFV的RNA复制水平。     

人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化

为优化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)原代及传代的培养方法,建立一种简便且能够获得数量较多及活力良好的HUVEC培养体系。分离脐静脉并插管,用0.1%的II型胶原酶灌注消化分离内皮细胞。M199完全培养基悬浮并接种于细胞培养瓶,37℃,5%CO2培养。待细胞铺满80%时,0.25%胰酶-EDTA消化传代培养。倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,姬姆萨染色法鉴定内皮细胞的形态,vWF因子相关抗原免疫荧光法鉴定内皮细胞。比较不同胶原酶消化时间、不同接种密度、不同胰酶消化时间、不同培养基组分对细胞得率、形态和纯度的影响。结果表明,原代培养时,II型胶原酶最佳消化时间为15min,最佳接种密度为1×106 mL-1;传代培养时,胰酶最佳消化时间为2min。倒置显微镜下观察和姬姆萨染色结果显示,贴壁内皮细胞呈长梭形,且呈单层铺路石状排列。免疫荧光检测结果表明,细胞胞浆呈绿色荧光,为vWF因子阳性细胞,DAPI衬染细胞核呈蓝色,显示内皮细胞纯度接近100%。本实验成功建立了HUVEC原代分离培养的优化体系,纯度高、活力好,为后续研究做好了准备。     

蒙古绵羊早期胚胎静脉系统的组织发生

蒙古绵羊胚胎发育到１７ｄ、１７ｈ,心房两侧有３对静脉原基发生,包括总主静脉,脐静脉及脐肠系膜静脉。胚胎发育到３０ｄ龄,左总主静脉右移分化成冠状静脉。右总主静脉则分化成前腔静脉。３０ｄ龄以后,左及右前主静脉间发生吻合,称左臂头静脉。左及右臂头静脉合并后汇总于前腔静脉。胚胎发育到２９ｄ龄,后主静脉前段及中段退化,后段分化成总髂静脉。脐肠系膜静脉发生于卵黄静脉。胚胎发育到２０～３０ｄ龄,在中肾的腹内侧发     

初生犊生脐病及先天不足症的防治

1.脐病 有脐出血和脐炎两种。脐出血有脐静脉出血和动脉出血。前者由于初生犊肺部肿胀不全．无呼吸作用时即进行断脐．致使卵圆孔封闭不合而引起．血液紫红色．点滴状流出。     

初生犊牛脐病及先天不足症的防治

1.脐病 有脐出血和脐炎两种。脐出血有脐静脉出血和动脉出血。前者由于初生犊肺部肿胀不全．无呼吸作用时即进行断脐．致使卵圆孔封闭不合而引起．血液紫红色．点滴状流出。     

奶牛静脉血、胎盘组织、脐静脉血及犊牛静脉血脂联素与犊牛初生重相关性研究

为探究奶牛静脉血、胎盘组织、脐静脉血和犊牛静脉血中脂联素之间及与犊牛初生重的相关性,选取规模化养殖场正常分娩奶牛54头,按犊牛初生重将奶牛分为3组:A组,≤40kg,9头;B组,40~45kg,25头;C组,≥45kg,20头。分别采集分娩奶牛颈静脉血、胎盘组织、脐静脉血及犊牛颈静脉血,ELISA法检测血液及胎盘组织脂联素水平,相关分析法分析各样品之间及与犊牛初生重的相关性。奶牛静脉血脂联素水平((29.15±4.02)mg/L)高于脐静脉血((13.79±1.14)mg/L)与犊牛静脉血((13.46±0.94)mg/L)脂联素水平,差异极显著(P0.01),脐静脉血脂联素水平高于犊牛静脉血脂联素水平,但差异性不显著(P0.05);奶牛静脉血脂联素水平与胎盘组织、脐静脉血、犊牛静脉血脂联素水平以及胎盘组织脂联素水平与脐静脉血、犊牛静脉血脂联素水平相关性均不显著(P0.05),脐静脉血脂联素水平与犊牛静脉血脂联素水平极显著正相关(P0.01);犊牛初生重与奶牛静脉血脂联素水平无显著相关性(P0.05),与脐静脉血、胎盘组织脂联素水平极显著正相关(P0.01),与犊牛静脉血脂联素水平显著正相关(P0.05);奶牛静脉血、胎盘组织、脐静脉血脂联素水平及犊牛静脉血脂联素水平在公、母犊间差异均不显著(P0.05)。脐静脉血、胎盘组织脂联素水平对犊牛初生重有非常显著的影响,犊牛静脉血脂联素水平对犊牛初生重具有一定影响,而奶牛静脉血脂联素水平对犊牛初生重的影响不显著;奶牛静脉血、脐静脉血、胎盘组织及犊牛静脉血脂联素水平在公、母犊间差异均不显著。     

不同猕猴桃叶片形态、解剖结构及其抗旱性评价

以4个猕猴桃品种‘徐香’‘葛枣’‘金猕’和‘脐红’作为材料,采用多功能图像分析法、指甲油印记法和石蜡切片法,对叶片的形态、气孔特征和解剖结构相关的21个指标（叶长、叶宽、叶片长宽比、宽基距、气孔宽、气孔器长、上表皮厚度、下表皮厚度、叶片厚度等）进行观察测量,结合主成分分析和相关性分析对21个指标进行抗旱指标筛选,并通过隶属函数法进行抗旱性综合评价,以期为猕猴桃抗旱品种选育提供理论依据。结果表明：气孔宽、叶片厚度和上表皮厚度被筛选作为抗旱性综合评价的关键指标,4 个猕猴桃品种的抗旱性依次为‘徐香’＞‘金猕’＞‘脐红’＞‘葛枣’。     

黄连素调节eNOS/NO保护软脂酸诱导的HUVECs损伤作用机制研究

目的：研究黄连素对软脂酸诱导人脐静脉内皮细胞（ HUVECs）损伤的保护作用,并初步探讨其作用机制.方法采用500μmol/L软脂酸培养HUVECs 24 h,建立内皮细胞损伤模型,MTT法观察黄连素对细胞存活率的影响;检测细胞培养上清液中一氧化氮（ NO）含量;RT-PCR法检测内皮型一氧化氮合酶（ eNOS） mRNA水平;Western blot方法检测eNOS和磷酸化eNOS蛋白的表达.结果与对照组比较,软脂酸组细胞存活率降低（ P〈0.05）,培养液中NO含量下降（P〈0.05）,细胞内eNOS mRNA水平、eNOS及磷酸化eNOS蛋白表达水平均显著下降（P〈0.01,P〈0.05）.与软脂酸组比较,黄连素组细胞存活率增加,培养液中NO含量明显提高（P〈0.05）,细胞内eNOS mRNA水平和磷酸化蛋白表达水平均显著提高（P〈0.01,P〈0.05）.结论黄连素对软脂酸引起的血管内皮细胞损伤有显著的保护作用,并可能与上调eNOS、促进NO生成有关.     

水稻新品种(组合)抗寒性鉴定研究

对湖南省1980份水稻新品种(组合)进行了抗寒性鉴定，筛选出抗和中抗的材料110份，其中抗(R)22份，中抗(MR)鹤份。并对上述部分材料进行了示范种植，取得了较好效果。     

副猪嗜血杆菌对猪气管上皮细胞的黏附作用及其黏附模型的建立

为了探讨副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)与原代培养的猪气管黏膜上皮细胞的相互作用,应用气管支气管结扎灌注酶冷消化法分离气管黏膜上皮细胞,于胶原覆盖的盖玻片上培养,使上皮细胞分化成假复层黏膜纤毛上皮细胞,然后以对数生长期不同Hps含量的菌液感染上皮细胞和猪脐静脉血管内皮细胞,分别作用1、2、34、h后,通过革兰氏染色法观察Hps对细胞的黏附情况。结果表明,Hps可黏附在上皮细胞和内皮细胞表面;Hps对气管上皮细胞有毒性作用,致细胞变性坏死和凋亡;Hps对细胞的黏附力与其在菌液中含量和作用时间有关,以菌落形成单位计,当含量为1.0×108mL-1且感染4 h后,黏附效果最好。高倍显微镜下可见大量Hps黏附于猪气管上皮细胞,只有个别Hps黏附于猪血管内皮细胞表面。说明Hps对猪气管黏膜上皮细胞的黏附能力远强于猪血管内皮细胞,可以利用猪气管黏膜上皮细胞建立副猪嗜血杆菌的黏附细胞模型。     

番茄脐腐病发生机理初步研究

以番茄品种津粉207、津－1、津－2、津－3为材料，对番茄脐腐病发生的机理进行了研究。病果中钾含量高于好果；好果的钙含量高于病果，说明果实中钙离子浓度与脐腐病的发生有一定的联系。不发生脐腐病的津粉207果实中钙离子含量比例比其他3个番茄品种低，说明脐腐病的发生不仅与果实中钙离子含量有关，还与钙离子转移到果实中的效率有关。     

芥菜品种资源对芜菁花叶病毒的抗病性鉴定研究

对367份榨菜和雪菜等芥菜类种质资源进行田间自然发病鉴定，筛选出对病毒病表现为免疫的材料20份。表现为高抗的材料30份，表现为抗病的材料29份。对96份自交3代以上材料苗期进行芜菁花叶病毒人工接种鉴定，筛选出11份抗病毒病材料，其中品种编号为06191和06222的2份榨菜对病毒病表现高抗，病情指数分别为3．13和3．57。06222田间鉴定和苗期接种鉴定均表现为高抗。芥菜病毒病抗源材料的筛选为抗病育种工作奠定了基础。