甘薯离体遗传转化研究进展

对甘薯遗传转化目的基因的来源、受体系统和转化方法,以及采用遗传工程改良甘薯品种等方面的研究进展进行综述,并讨论了今后的研究重点。     

STTM165/166转化水稻的初步研究

为研究miR165/166在水稻中的功能,利用含有miR165/166结合位点(STTM165/166)的植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻品种日本晴,经过抗性筛选、分化培养、生根培养,获得转基因水稻植株。经PCR检测,STTM165/166已成功转入水稻基因组中,部分转基因水稻植株存在叶形扭曲、植株矮化等表型变异。     

影响农杆菌介导的大豆基因转化因素的研究

通过农杆菌介导法用含NPT－Ⅱ和Barnase基因导入到大豆幼胚，大豆子叶节叶，然后经过含Kan的筛选培养基中连续筛选，获得一批Barnase转基因植株。经PCR扩增结果，证实此基因已整合到大豆中，在当代植株中生物学特性观察，花粉粒不育率在98％。     

农杆菌介导glgC-TM基因转化水稻研究

 利用农杆菌介导将glgC-TM基因导入多个水稻品种。研究表明农杆菌转化过程中，潮霉素是一种很好的筛选剂，成熟胚以及国产的羧苄青霉素不适宜用作农杆菌介导的遗传转化。不同品种以及不同的质粒在转化过程中对抗性愈伤的得率和阳性植株的转化率不存在显著影响。T1代PCR检测表明，在转基因当代就有可能获得转基因纯系。     

植酸酶基因phyA转化大豆品种研究

土壤磷多以有机态形式存在,而植酸磷占一半以上,分解利用植酸态磷是提高土壤磷利用效率、改善植物磷素营养的新途径.利用大豆农杆菌介导子叶节转化与花粉管通道转化技术,将含有根特异启动子pyk10、信号肽S和植酸酶phyA的嵌和基因(KSA)转入冀豆12、冀豆16、五星1号和吉林35中.经PCR检测,共获得T0阳性植株114个...     

以农杆菌为介导花生遗传转化研究

应用花生丛生芽再生体系，以农杆菌为介导将含有几丁质酶和β－1，3－葡聚糖酶抗病基因的植物双价表达载体pCGII转入花生品种泉花10号和金花1012，获得转基因植株，并已通过PCR和Southern blot鉴定，研究表明，侵染时间以5－15min的效果较好，侵染时间过长不利于提高转化率；0－1d预培养对基因转化有利，预培养2d可使转化率下降。     

通过农杆菌介导法将Bt(cryIA)基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将Bt基因（cryIA)导入大豆，从发芽5-7天的大豆无菌苗切取子叶节外植体，经农杆菌感染和共培养后，在选择培养基上4周左右出现抗性不定芽，将不定芽转移到芽伸长培养基上，4-6周后再生苗长至2.5-3cm高，再将再生苗切下转入生根培养基，2周左右生根，生根后的再生植株经逐步锻炼移入盆中，所有植株均能正常开花结英，在移栽成活的8株T0植株中有7株PCR检测呈阳性反应；在7个T1株系中有4个株系存在PCR阳性植株，取4个稳定遗传的T1代株系内的阳性植株的叶片提取DNA，用地高辛标记的Bt基因探针进行Southern杂交分析，结果4个株系均呈现阳性，证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内并能传递给后代。     

农杆菌介导的转ICE1基因提高水稻的耐寒性

利用农杆菌介导的转基因技术,成功地将通过RT PCR克隆的拟南芥ICE1基因导入垦鉴稻10号中,经PCR和Southern检测确认目的基因已整合到水稻基因组中。潮霉素抗性测定结果表明,与未转基因水稻相比,T1代表现出对潮霉素较高的抗性和孟德尔式的单位点遗传。抗寒能力检测结果表明,在同等低温胁迫条件下T1代转基因株系的死亡率明显低于未转基因对照。脯氨酸含量增幅明显高于未转基因对照。上述结果表明,转ICE1水稻提高了抗寒能力。     

水稻农杆菌转化体系中共培养方法的优化

[目的]对水稻农杆菌转化体系中共培养过程进行优化。【方法】以水稻品种日本睛作为材料,对2种不同的共培养方法,即将1层无菌滤纸铺于固体共培养基表面和用0．5mLAAM培养液浸湿的无菌滤纸的方法进行比较。【结果】无菌滤纸用0．5mLAAM培养液浸湿后铺于培养皿,后直接将浸染后的愈伤组织在其上进行共培养,效果好且染菌少。【结论】利用0．5mLAAM浸湿的滤纸培养既简化操作又有利于愈伤组织生长。     

一种简便的获得无标记耐盐转基因水稻植株的NaCl有效筛选浓度选择法

 以4个粳稻品种(日本晴、秀水11、武运粳7号、中花11)为材料, 研究发现,在含NaCl的NB培养基上,NaCl对水稻种子发芽的抑制率与对成熟胚愈伤组织生长的抑制率之间呈线性正相关。水稻种子发芽抑制率达50%左右时的NaCl浓度与愈伤组织生长抑制率达80%左右时的NaCl浓度一致,可以作为耐盐基因转化水稻时NaCl有效筛选浓度的重要参考。由此获得日本晴、武运粳7号和中花11 NaCl有效筛选浓度为200 mmol/L,秀水11 NaCl有效筛选浓度为250 mmol/L。采用上述浓度的NaCl对BADH基因转化的日本晴和秀水11愈伤组织进行筛选,成功获得了无标记基因的转基因水稻植株,转化率分别达到38.9%和32.0%。建立的NaCl筛选浓度确定法通过测定NaCl对水稻种子的发芽抑制率来确定水稻耐盐基因转化时合适的NaCl筛选浓度,操作简便,实验周期短,无需其他抗性标记基因。     

利用农杆菌介导法将PVA-CP基因导入马铃薯品种东农303的研究

以马铃薯早熟品种东农303的微型薯为受体材料,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究,成功地将PVA-CP基因导入马铃薯中。结果表明:在加入5mg·L-1ZT和1mg·L-1IAA的培养基上微型薯再生频率最高达95%;农杆菌侵染薯块时,用浓度为OD600=0.5的菌液,侵染5min,共培养2d转化频率最高;在诱导芽阶段加入75mg·L-1的卡那霉素,采用延迟筛选的方法。得到的抗性芽有22株在含100mg·L-1卡那霉素的培养基上生根。经PCR和PCR-Southern杂交检测,15株为阳性植株。初步证明了PVA-CP基因已导入并整合到马铃薯品种东农303的基因组中。     

农杆菌介导将雪莲凝集素(GNA)基因转入籼稻单倍体微芽的初步研究

 以含有双元载体(携带GNA基因,nptⅡ基因)的根癌农杆菌菌系LBA4404转化籼稻单倍体无性系微芽Hu18,经共培养后在含G418的保存培养基中连续筛选G418抗性芽,抗性芽经生根培养基中壮苗获得单倍体转化植株。PCR分析证明GNA基因已进入到Hu18细胞中,抗虫鉴定表明转基因植株具有白背飞虱抗性。并探明了G418对单倍体微芽的致死浓度和时间,共培养时间对G418抗性芽产生的影响。      

根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。     

农杆菌介导的CyMV-CP基因对石斛遗传转化研究

以本实验室构建的含有建兰花叶病毒外壳蛋白基因(CyMV-CP)的pBI121为表达载体,以继代培养2～3次的石斛类原球茎为转化受体,用农杆菌介导法转化石斛,建立并优化了石斛的遗传转化体系。结果表明:类原球茎经农杆菌菌液(OD600值为1.0)侵染30 min后,24℃培养4 d,用头孢霉素(500 mg/L)脱菌后转接到卡那霉素(150 mg/L)筛选培养基中进行筛选培养;对获得的转CyMV-CP石斛进行PCR和实时荧光定量RT-PCR检测,表明目的基因已经整合到石斛基因组中,并得到表达。所建立的转化体系,受体材料来源丰富、转化过程简单,可重复性强、转化效率高、假阳性少,适合于石斛的遗传转化研究。     

水稻除草剂敏感基因导入恢复系的研究

以农林８号ｍ为主体亲本与优良恢复系杂交,成功地将除草剂（苯达松）敏感基因转育到恢复系中,携带该基因的恢复系不但对苯达松敏感（抽穗期用１８００￣２７００ｍｌ／ｈｍ＾２苯达松喷施可使整穗或整株死亡）,而且所配组合具有较强的杂种优势。     

茶树甜菜碱醛脱氢酶基因(CsBADH1)的全长cDNA克隆与表达分析

甜菜碱是一种能在逆境下大量积累的无毒性渗透相溶物质,而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是甜菜碱合成途径中的关键酶之一。本实验采用SMART-RACE技术获得了茶树甜菜碱醛脱氢酶基因的全长cDNA序列,命名为CsBADH1(GenBank登陆号:JX050145),并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明:CsBADH1的cDNA序列全长1 972 bp,其开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸,预测分子量为54.8 kD,理论等电点(PI)为5.652,是疏水性很强的蛋白,且具有BADH基因典型的高度保守十肽基序(VTLELGGKSP)和与醛脱氢酶(ALDHs)功能有关的半胱氨酸残基(C)。系统进化树分析表明,茶树BADH氨基酸序列与人参(Panax ginseng)的亲缘关系最近,相似度达87%,其余相似性也大部分在80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示:该基因在经历一定时间的冷驯化后表达量升高,说明CsBADH1基因可能参与茶树的冷驯化作用。     

农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行 PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。     

水稻矮败型细胞质雄性不育恢复基因的定位

 在由210个测交组合组成的协青早A/(协青早B/密阳46)F6群体中，应用RFLP和SSLP标记，在第10染色体RZ811～RG561区间，定位了1个控制水稻矮败型细胞质雄性不育育性恢复的主效基因，与RZ811相距 4.0 cM，对群体变异的贡献率为 43.2%。应用极端群体分析法，其定位结果一致。