猕猴桃花青素合成途径基因AcCHS 和AcLDOX的克隆与表达分析

 根据物种水平上蛋白保守序列设计特异引物,扩增获得‘红阳’猕猴桃花青素合成途径中查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）和无色花青素双加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX）基因的特异片段,用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆出这两个基因的cDNA全长,长度分别为1501 bp（AcCHS）和1381 bp（AcLDOX）,分别编码389个和355个氨基酸。通过比对发现AcCHS与棉花（Gossypium hirsutum）、山茶（Camellia japonica）和黄蜀魁（Abelmoschus manihot）的CHS序列相似性较高,达到95%,与葡萄（Vitis vinifera）和苹果（Malus × domestica）的相似性分别为94%和93%;AcLDOX与山葡萄（Vitis amurensis）和葡葡的相似性分别高达94%和93%。用实时荧光定量PCR分析AcCHS和AcLDOX在‘红阳’（红肉）、‘金魁’（绿肉）和‘金农’（黄肉）3种不同果肉颜色的猕猴桃内果皮中的表达,发现AcCHS的表达量在‘红阳’果实转色期（花后65 d）较高,而在‘金农’开花后表达量呈持续下降趋势;AcLDOX在‘红阳’果实发育早期呈上升趋势,花后65 d后迅速下降,在‘金魁’果实发育后期呈明显上升趋势,在‘金农’开花后呈持续下降趋势。     

马铃薯花青素转录激活基因stwd40的克隆与表达分析

根据GenBank中报道的茄属植物矮牵牛花青素wd40类转录激活基因an11及番茄wd40基因113964R的mRNA序列的保守区结构,设计简并引物,从紫色马铃薯皮中克隆了马铃薯wd40类转录激活基因的保守片段,再利用RACE技术分别获得了该基因的3′端和5′端。序列分析表明,该基因核苷酸序列为1292bp,具有完整的编码框,推导其编码362个氨基酸,命名为stwd40。推测的氨基酸序列与GenBank数据库中大量物种的花青素转录激活蛋白wd40有较高的同源性,其中与矮牵牛花青素转录调控基因an11的相似性达86%。RT-PCR表达分析显示stwd40在紫色马铃薯叶、茎、皮、肉及根中都有表达,其中在茎中的表达量最高,肉中表达量最低;其在白色马铃薯的叶、皮和肉中也有表达,推测该基因为组成型表达。     

茄子生长素诱导基因SmIAA19的克隆和分析

以茄子单性结实品系‘D-10’为材料,以茄子单性结实差减文库中差异表达的EST片段Z732为依据,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了生长素诱导基因SmIAA19（登录号KP114221）的cDNA序列。该基因全长为800 bp,开放阅读框为558 bp,编码185个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明该基因编码的氨基酸序列具有Aux/IAA基因家族的典型结构域和保守基本序列,在分子进化上与马铃薯距离最近,与番茄处于同一分支。qRT-PCR分析表明,在低温（门茄）和适温（四门斗）条件下,SmIAA19在单性结实和非单性结实的子房和果实发育过程中均有表达,单性结实品系中的表达量显著高于非单性结实品系,单性结实品系开花当天子房中的表达量最高,非单性结实品系在低温和适温条件下的表达量均保持在较低的水平。IAA含量检测结果表明,在不同结实性茄子品系的果实发育过程中IAA含量的变化趋势基本相同,在果实发育前期含量较高,且在低温（门茄）条件下,不同结实性果实中IAA的含量变化与SmIAA19基因的表达量变化相一致。SmIAA19基因可能与茄子的单性结实有关。     

茄子单性结实候选基因的表达分析

对茄子单性结实抑制差减文库中的1 248个差异表达unigenes在GeneBank数据库中进行BLAST比对分析,结果表明1 109个unigenes具有同源序列,其编码的蛋白包括甲硫氨酸亚砜还原酶、MADS-box转录因子、组蛋白和隐花色素等,涉及到果实发育的多个方面,139个unigenes没有同源序列,可能为新基因。利用荧光定量PCR研究10个差异表达unigenes在茄子单性结实果实和非单性结实果实发育过程中的表达模式,分析表明,在低温条件下,unigenes Z569和Z707在单性结实果实发育中特异表达,可能与单性结实果实的形成有关,可作为研究单性结实的候选基因。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

紫山药花青素调控基因DaF3H的克隆及表达分析

 以富含花青素的紫山药‘蓣引紫006’为材料,克隆得到花青素生物合成途径中关键酶基因DaF3H（KF561995）,其序列全长为1 325 bp,最大开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸。DaF3H蛋白属于水溶性的胞质不稳定蛋白,无跨膜区和信号肽结构,为α–酮戊二酸和二价铁离子依赖型的加氧酶家族[2OG-Fe（Ⅱ）Oxygenase superfamily]。氨基酸序列与胡桃（ACR47976）、琴叶拟南芥（CAC26921）相似性最高,达到80%。DaF3H在山药幼叶中表达量最高,在成熟叶片和茎中几乎不表达。茎叶和块茎中花青素积累量增速与DaF3H表达密切相关。运用接头PCR法对DaF3H的启动子序列进行了克隆,元件预测显示该序列中存在GT-1光调控元件以及生长素、金属离子、MYB-bZIP-MYC等元件的结合位点,叶片遮光处理试验表明,DaF3H受光调节。     

茄子3个Aux/IAA基因的克隆及表达分析

以茄子单性结实品系‘D-7-1’为材料,克隆到3个新的Aux/IAA基因,分别命名为SmIAA3、SmIAA4和SmIAA9,其CDS长度分别为573、564和915 bp,分别编码190、187和304个氨基酸;系统进化树分析表明,3个蛋白均属于Aux/IAA家族蛋白,与番茄亲缘关系较近,且均具有Aux/IAA家族蛋白的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ 和 Ⅳ 保守结构域;其分子量分别为21.50、20.95和32.67 kD,理论等电点分别为7.62、6.02和8.57。实时定量PCR分析表明：SmIAA9基因在单性结实和非单性结实品系茄子中的表达量差异明显,开花前单性结实品系的表达量显著高于非单性结实品系,推测其与茄子单性结实相关。     

红掌查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

以红掌栽培品种‘Dakota’为材料,采用RACE技术克隆获得AnCHI基因的cDNA序列,分析花青素含量与该基因表达的关系,进一步完善红掌花青素合成途径。结果表明：AnCHI序列全长为1 117 bp,其中开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸;AnCHI在不同时期红掌佛焰苞以及根、茎、叶、肉穗组织中均有表达,且在佛焰苞发育前期表达量明显高于后期,测得花青素含量与基因表达量变化基本一致;构建的pGEX-4T1-AnCHI重组表达载体在原核中正确表达。初步验证了AnCHI的表达可能对红掌佛焰苞花青素的合成有一定促进作用。     

马铃薯花青素转录激活基因stwd40的克隆与表达分析

根据GenBank中报道的茄属植物矮牵牛花青素wd40类转录激活基因an11及番茄wd40基因113964R的mRNA序列的保守区结构,设计简并引物,从紫色马铃薯皮中克隆了马铃薯wd40类转录激活基因的保守片段,再分别利用RACE技术获得了该基因的3'端和5'端。序列分析表明,该基因核苷酸序列为1292bp,具有完整的编码框,推导其编码362个氨基酸,命名为stwd40。推测的氨基酸序列与GenBank数据库中大量物种的花青素转录激活蛋白stwd40有较高的同源性,其中与矮牵牛的花青素转录调控基因an11的相似性达86%。RT-PCR表达分析显示stwd40在紫色马铃薯叶、茎、皮、肉及根中都有表达,其中在茎中的表达量最高,肉中表达量最低,且在白色马铃薯的叶、皮和肉中也有表达,推测该基因为组成型表达。     

观赏向日葵花青素苷合成途径同源基因的克隆与表达

 根据已发布基因的保守区域设计引物,从观赏向日葵（Helianthus annuus L.）舌状花中克隆到花青素苷生物合成途径中PAL、CHS、CHI、F3'H、DFR和ANS等6个结构基因的保守序列。序列分析表明6个结构基因与其它植物来源的花青素苷生物合成相关基因均具有较高的同源性,分别为95%～97%、83%～99%、64%～80%、80%～82%、64%～85%和87%～89%。系统进化分析表明6个结构基因的系统进化基本上符合植物分类学分类。半定量RT-PCR分析,表明除CHS基因在管状花中未表达外,6个基因在舌状花、管状花、花蕾、叶片、茎皮中均有表达;大部分基因在花开放初期和盛期的表达较高,而花完全开放后,所有基因的表达量降低;观赏向日葵花青素苷合成相关基因的表达量在紫红色花瓣中高于红褐色,深色花瓣高于混杂色花瓣。     

红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析

以红皮梨‘奥冠’为试材,采用RT-PCR结合RACE技术获得1个MYB基因,命名为PyMYBa。该基因开放读码框共714 bp,编码237个氨基酸。PyMYBa分子量27.4 kD,等电点8.78。氨基酸序列分析显示,在其N端具有保守的R2R3-MYB结构域,R3-MYB结构域含有bHLH结合基序。进化树分析表明,PyMYBa与花青苷调控MYB转录因子的同源性很高。基因表达结果表明,PyMYBa在梨叶、花、果皮中表达量明显高于果肉,果皮中的表达量与花青苷调控基因PyMYB10相比,无显著差异。遮光及MeJA处理后果皮中PyMYBa、PyMYB10的表达量变化与花青苷合成量变化趋势相似,推测PyMYBa为梨花青苷合成中重要的正向调控因子。通过原核表达试验获得了该基因的重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测结果与预期蛋白分子量一致。     

甘蓝自交不亲和相关转录因子BosiPA1 蛋白基因的克隆与表达分析

 通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉1 h 和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比,鉴定出1 个受 自花授粉诱导上调表达的蛋白,通过PCR 技术获取了其编码序列,命名为BosiPA1 蛋白,其基因全长为 3 730 bp,具有1 个1 092 bp 的完整编码框（KF314579）。BosiPA1 由6 个外显子、5 个内含子组成,编码 363 个氨基酸。序列分析表明BosiPA1 蛋白具有典型的basic helix-loop-helix（bHLH）功能域,在SCR、SRK、 Exo70A1 基因的ATG 上游启动子序列中存在可以被bHLH 功能区识别并结合的E-box（CANNTG）序列。 在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128 距离最近,与AtHEC1/2/3 和TgGBOF-1 处在同一个分支。RT-PCR 检测表明甘蓝BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达;荧光定量PCR 分析表明BosiPA1 基因在自花授粉10 min、30 min、1 h 的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明BosiPA1 与bHLH 的进化 分支较早,可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。     

黄瓜果实弯曲相关基因Cs14-3-3 的克隆及表达分析

 以黄瓜（Cucumis sativus L.）果实易发生弯曲的品种‘长春密刺’为试验材料,采用RT-PCR 技术从果皮中分离并克隆了14-3-3 蛋白基因,并将此基因命名为Cs14-3-3。Cs14-3-3 基因cDNA 全 长792 bp,编码263 个氨基酸,分子量29 589.287 Da,等电点为4.585。生物信息学分析表明此基因含有 14-3-3 蛋白基因的典型结构域,与其他物种14-3-3 蛋白基因核苷酸序列同源性达到75%以上,编码的氨 基酸序列同源性达到85%以上,属于14-3-3 蛋白基因家族。同时,采用实时荧光定量PCR 方法对顺直果 实和弯曲果实腹部及脊部在果实开花的2、4、6、8、10、12 d 的基因表达量进行了研究。结果显示,在 果实发育各个时期,Cs14-3-3 的表达量均为在弯曲果实腹部 > 顺直果实 > 弯曲果实脊部的表达量;在 各个部位,Cs14-3-3 在果实开花2 d 的表达量明显高于开花后其他时期。试验结果表明,Cs14-3-3 基因为 黄瓜果实弯曲相关基因,在黄瓜果实开花早期发育过程中起重要作用。     

‘红颜’草莓菌根磷转运蛋白基因的克隆及荧光定量表达分析

 采用MEGA5.0 软件对9 个森林草莓无机磷转运蛋白序列及58 个已知的其它植物磷转运蛋 白的氨基酸序列进行聚类分析,发现5 个基因与菌根磷转运蛋白基因分支聚在一起,初步判断是候选的 草莓菌根磷转运蛋白。根据其基因序列设计引物获得了5 个‘红颜’草莓候选菌根磷转运蛋白基因全长。 实时荧光定量PCR 结果表明,FaPT4、FaPT5 和FaPT8 在草莓菌根中显著上调表达,结合聚类分析结果, 证明这3 个基因是‘红颜’草莓菌根磷转运蛋白基因。     

茎瘤芥AP2/EREBP 转录因子基因BjABR1 的克隆和表达分析

 以茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）‘永安’为材料,通过RACE 和RT-PCR 技术得到1 个AP2/EREBP 转录因子基因的cDNA 全长序列和基因组DNA（gDNA）序列,该基因与拟南 芥AtABR1 基因的氨基酸序列相似性高达72%,因此命名为BjABR1（GenBank 登录号：JQ713825.1）。BjABR1 基因gDNA 序列含1 个内含子;cDNA 序列全长1 514 bp,含有1 个1 146 bp 的开放阅读框（ORF）,编 码381 个氨基酸;其推定编码的蛋白分子量为41.674 kD,等电点为9.11,具有14 个磷酸化位点,含1 个典型的AP2 DNA 结合域和1 个CMX-1 基序。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,BjABR1 蛋白定位于细 胞核。荧光定量PCR 分析结果表明,该基因在茎瘤芥不同发育时期的根、茎、叶中均有表达,但在根中 表达量极高;在对茎瘤芥组培幼苗进行高盐、渗透压和低温3 种非生物胁迫处理后发现,3 种胁迫均能诱 导该基因表达,但其对高盐的响应更为迅速。     

茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析

利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(Sm Msr A)的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个分别含Sm Msr A基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体p TRV2-Sm Msr Ai。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和q RT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对Sm Msr A基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,Sm Msr A基因沉默后叶片呈花叶状,果实变小,叶片和果实中的Sm Msr A基因的表达量明显降低,表明Sm Msr A基因是正向调控茄子果实发育的相关基因。     

黄瓜贝壳杉烯氧化酶基因CKO 的克隆及其表达分析

 以‘戴多星’黄瓜为试材,应用同源克隆和RACE技术从茎尖中得到赤霉素合成的关键酶--贝壳杉烯氧化酶（KO）基因cDNA全长序列,命名为CKO,GenBank登录号为JN792591,其长度为1 895 bp,开放阅读框（ORF）编码519个氨基酸,相对分子量为59.211 kD,等电点（PI）8.45。氨基酸同源性分析发现,CKO与苦瓜的KO同源性最高,达84%;序列结构分析表明,CKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域。实时荧光定量分析表明,CKO在遮荫的徒长苗中表达量最高,是正常苗的5.18倍,在遮阴条件下喷施多效唑可降低期表达。