一种快速、特异性检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata）的巢式 PCR 方法

为建立检测小麦中链格孢菌（Alternaria alternata ）的方法,从河南省小麦黑胚籽粒上分离得到7个优势 A．alternata 病原菌株,对其 rDNA 的内部转录间隔区序列（ITS）进行测序,序列比较表明,分离到的病原菌株与 GenBank 公布的 A．alternata 的 ITS 区序列一致性达到99％～100％。根据 Alternaria 属菌株（A．alternata、A．tenuis、A．tenuissima）和麦类根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana ）的 ITS 序列比对结果,设计出1对 A．alternata 特异性引物 Aa1F/Aa1R。利用多种河南省小麦的主要病原真菌对该引物的特异性进行验证,只有在 A．alternata 中能特异性地扩增出1条443 bp 的 DNA 片段。以真菌通用引物 ITS1/ITS4为外侧引物、特异性引物Aa1F/Aa1R 为内侧引物进行巢式 PCR 扩增,能检测到 A．alternata DNA 的最低质量浓度为50 pg/μL。因此,建立的巢式 PCR 方法能够快速、特异地检测小麦中的 A．alternata。     

云南烟草赤星病菌及近似种rDNA ITS序列分析

 为了进一步研究云南省烟草赤星病病原的系统发育关系,提取28份供试菌株的菌丝基因组DNA,进行rDNA ITS序列及两侧ITS序列扩增。28个供试菌株与GenBank中登录的链格孢属7个种（包括5个小孢子种Alternaria citri,A．alternata,A．longipes,A．mali,A．gaisen和2个大孢子种A．porri,A．solani）14个菌株的序列进行聚类分析：42个菌株明显地分成两支,供试菌株与5个小孢子种聚为一个分支,序列同源性高达99％～100％,没有明显的地域性差异;但另2个大孢子种聚为单独的一支,明显地与供试菌株和其他5个小孢子种区分开。rDNA ITSl 58S ITS2序列在相对保守的基础上又存在一定变异,在一些菌物属的研究中可作为分类鉴定、分子标记、系统发育的重要依据,但通过对世界各地Alternaria菌株序列的分析发现,rDNA ITS1 58S ITS2仅能将大孢子种和小孢子种分开,还不能作为区分不同地域不同来源菌株的标准。     

一株野生大型真菌的菌种分离及ITS序列鉴定

[目的]寻找适宜杨树林下栽培的野生食用菌菌种。[方法]对采集自辽宁省阜新市蒙古族自治县银中杨林下的野生大型真菌进行菌种分离,同时研究不同分离部位对菌丝生长的影响,并对获得菌丝进行了rDNA ITS序列分析。[结果]菌盖与菌柄连接处为菌种最佳分离部位。对分离株rDNA ITS片段进行PCR扩增,扩增产物长度为692 bp,登录NCBI与GenBank中已知的菌种进行Blast比对,序列与Agaricus bitorquis(Quél.)Sacc的Query cover为97%~100%,ident均为99%。[结论]鉴定分离菌种为蘑菇科、蘑菇属、大肥菇。该研究可为下一步开展杨-食用菌复合经营提供菌种准备。     

野生柑橘炭疽病鉴定

本研究对华中农业大学野生柑橘上的病害进行鉴定。运用形态学及ITS序列分析方法对病样进行系统鉴定。结果表明,从发病的野生柑橘枝稍病样上共分离到24个单孢菌株,这些菌株根据形态学及ITS序列分析方法分为3种真菌:(1)菌落粉红色,长势非常缓慢,孢子镰刀形,ITS序列分析鉴定为砖红镰孢菌Fusarium lateritium;(2)菌落灰黑色,气生菌丝多,孢子砖格状,ITS序列分析为链格孢菌Alternaria alternata;(3)菌落灰白色,气生菌丝较少,常产生橙色胶滴和黑色小粒点,分子孢子短杆状,ITS序列分析为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。利用健康柑橘枝条对此3种真菌进行回接实验时,接种胶孢炭疽菌的枝条出现了跟采样枝条相同的症状,而且从发病的枝条上又分离到同样的炭疽菌;而接种链格孢及砖红镰孢的枝条不发病。该病害鉴定为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides感染引起的炭疽病。     

河南商丘月季黑斑病病原菌鉴定及生物学特性

月季是一种世界上常见的、重要的观赏植物.2019年10月在河南省商丘市平原路、长江路、文化路等绿化带发现月季植株患有黑斑病,为鉴定河南省商丘市月季黑斑病病原菌,采集月季患病植株叶片,使用单孢分离法对该病原菌进行分离,纯化得到1株病原菌SQYJAA-1.对该病原菌SQYJAA-1进行形态学鉴定,利用室内人工接种的方法对其进行致病性测定,对其rDNA ITS、GPD和EF1-α等3个基因序列进行PCR扩增和测序分析.结果表明,病原菌的分生孢子为棕褐色,呈倒棒状,表面有横隔膜和纵隔膜.该菌株能使健康月季离体叶片出现黑斑病病症.多基因系统进化分析表明,该病原菌菌株SQYJAA-1(ITS序列MN495846,GPD序列MK683866,EF1-α序列MT133312)与链格孢(Alternaria alternata)(ITS序列MN495797,GPD序列MK683865,EF1-α序列KY094931)聚于1个分支,由此确定河南省商丘市月季黑斑病病原菌SQYJAA-1为链格孢.生物学特性分析表明,SQYJAA-1菌丝最适宜生长的温度为28℃,pH值为6.0,光照条件为24 h光照,最适宜SQYJAA-1菌丝生长的碳源为葡萄糖,氮源为蛋白胨.研究结果为河南省商丘月季黑斑病的防治提供了理论依据和应用价值.     

核桃叶斑病病原菌的分子鉴定

[目的]明确引起喀什地区核桃叶斑病的病原,有效防控该病害的扩展和蔓延,为病害的进一步防治奠定理论基础.[方法]采用常规组织分离法对病样进行分离,对病原进行形态学和分子生物学鉴定.[结果]从喀什叶城和莎车两个县的8个核桃园中采集典型的核桃叶斑病标本,经分离培养纯化及接种试验,确定了喀什地区核桃生产园叶斑病的病原.选取代表性菌株进行培养观察和测定,并采用真菌rDNA-ITS通用引物(ITS1F-ITS4)进行PCR扩增并测序,获得序列登录GenBank进行比对分析.根据形态学和分子生物学实验结果,确定引起核桃叶斑病的病原菌为链格孢菌Alternaria alternata.[结论]喀什地区核桃叶斑病主要由链格孢菌Alternaria alternata (Fries) Keissle侵染引起.     

广西桂花叶枯病病原菌鉴定及其生物学特性研究

在广西南宁桂花树上严重发生一种叶枯病,从病叶上分离到桂花叶枯病菌(编号CHS),在致病性测定的基础上,根据病原菌株CHS的形态及ITS序列,将其鉴定为Alternaria alternata(Fr.)Keissler.对该菌的生物学特性研究结果表明:菌丝生长、孢子形成和孢子萌发的最适温度均为28 ℃;生长发育最适pH值为6～7;不同光环境对该菌菌丝生长发育影响不大,黑光环境最利于孢子萌发;在供试的培养基中PDA最适合菌丝生长和产孢;苯醚甲环唑、咪鲜胺和丙环唑对该菌的抑制作用最强.由A. alternata引起的桂花叶枯病在广西的发生属首次报道.     

黑龙江省水稻穗腐病致病菌(Alternaria spp.)的鉴定及生物学特性分析

黑龙江省是我国水稻主产区,近年水稻穗腐病(rice spikelet rot disease,简称RSRD)对黑龙江省水稻产区的产量与质量造成的危害越来越严重。本研究旨在对黑龙江省水稻穗腐病致病菌链格孢属(Alternaria spp.)菌株的种类及生物学特性进行分析,为水稻穗腐病的防控提供参考依据。从黑龙江省病害发生区采集病穗样本,分离获得病原菌纯培养,利用分生孢子及菌落形态做形态鉴定,结合内转录间隔区(internal transcribed spacers,简称ITS)进行分子鉴定,菌丝生长速率法明确其生物学特性再采用水解圈法测定3种外分泌酶的产生情况。研究结果表明,黑龙江省水稻穗腐病的主要致病菌为Alternaria spp.,占总病原数量的83.43%;根据菌落及分生孢子形态把Alternaria spp.分成8种类型,ITS分子鉴定结果可将Alternaria spp.分为3类,分别为细交链格孢菌(Alternaria tenuissima,Ⅰ类菌),占Alternaria spp.总数的48.65%;链格孢菌(Alternaria alternata,Ⅱ类菌),占48.6...     

我国部分区域链格孢属 rDNA ITS区序列分析

[目的]对我国部分区域链格孢属rDNA ITS序列进行分析,从而在分子水平上对其进行鉴定。[方法]使用通用引物ITS4和ITS5对分离自我国部分区域不同寄主链格孢属（AlternariaNees）34个菌株进行ITS基因（ITS1-5.8S-ITS2）的PCR扩增和测序。[结果]序列分析结果表明：5.8S rDNA全长为159 bp,保守程度高,参试的34株菌均一致;ITS区变化相对较大。与A.tenuissima或A.alternata100%同源的分离菌株均表现出对地域和基质的广适性;菌株在5.8S/ITS存在的差异,说明寄主本犀科的丁香叶、蔷薇科、茄科等部分植物的链格孢具有一定的多样性。但同时也发现ITS序列标记在链格孢属部分种间应用有一定的局限性;基于序列ITS1-5.8S-ITS2聚类关系与其地理来源和寄主相关性不大。[结论]ITS序列分析法可为链格孢属的分子鉴定提供理论依据。     

切花红掌炭疽病和叶霉病的病原鉴定

红掌炭疽病和叶霉病是危害切花红掌生产的两种重要病害。本研究通过传统形态学结合分子生物学方法对切花红掌生产中两种主要病害进行鉴定,并确定病原菌的分类地位。从感病植株上通过常规组织分离法获得病原菌株,对其进行形态学观察和致病性测定,通过ITS序列分析和比对,对其进行分子鉴定。结果表明:红掌炭疽病的致病菌为Colletotrichum gloeosporioides,与GenBank中查到的登录号为KC172072.1的ITS序列同源性最高,同源性大于99%;红掌叶霉病系复合侵染,其致病菌为Cladosporium cladosporioides和Alternaria alternata,分别与GenBank中查到的登录号为KC880082.1和JX406531.1的ITS序列同源性最高,同源性分别为96%和97%。分子生物学鉴定与形态学鉴定结果一致。     

交链格孢菌EST-SSR信息分析与分子标记通用性评价

为了弄清交链格孢菌(Alternaria alternata) EST数据库中的SSR信息资源,并开发可用于研究近缘种细极链格孢(Alternaria tenuissima)遗传多样性的EST-SSR分子标记。从NCBI数据库下载A.alternata表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)共727条,经过研究分析发现,A.alternata EST中SSR含量非常丰富,每5.343 kb含有1个SSR位点。根据SSR两端保守序列,设计合成13对EST-SSR引物,对来自新疆不同地区不同寄主的38株A.tenuissima进行通用性检测。检测结果显示共有5对引物能扩增出多态性条带,扩增多态率为55.56%。因此,基于A.alternata EST数据库开发的SSR分子标记,在开展近缘种A.tenuissima遗传多样性研究时具有较好的通用性。     

安徽省草莓空心病病原菌的分离与鉴定

对来源于安徽、辽宁和河北地区的草莓空心病株的病原菌进行了分离、纯化、形态观察以及分子生物学鉴定。结果显示,该病原菌在PDA平板上均呈放射状,菌丝的颜色一般为白色,菌丝上具有分枝且分生孢子呈椭圆形和镰刀形。使用PCR法扩增该病原菌的ITS和18S rDNA的序列并进行DNA克隆和测序。根据测序结果,对病原菌的ITS和18S rDNA序列的BLAST同源性对比和系统进化树分析。最终根据病原菌的外部特征和分子鉴定的结果证明引起草莓空心病的病原菌为Fusarium solani。该研究为草莓空心病的防控提供科学依据。     

重庆地区蚕豆叶部链格孢菌的鉴定及其生物学特性研究

[目的]对重庆地区危害蚕豆叶部的链格孢菌进行鉴定,并对其生物学特性进行研究。[方法]从重庆市分离得到蚕豆叶部链格孢属真菌16株,对其中代表性的2株进行形态学观察、分子鉴定和致病性测定,并对该病原菌的生物学特性进行研究。[结果]根据ITS和EF 2个基因序列的比对,明确2株菌分别属于链格孢(Alternaria alternata)和细极链格孢(Alternaria tenuissima)。2株病原菌菌丝在PDA培养基上生长最适温度为28℃,最适p H为7。[结论]该研究为重庆蚕豆链格孢病害研究提供参考。     

利用麦秸秆基质驯化栽培中国美味蘑菇

利用麦秸秆基质对野生中国美味蘑菇(Agaricus sinodeliciosus)进行驯化、栽培,研究生长阶段中菌丝、原基和子实体的生物学特性,并将供试菌株rDNA ITS区域序列进行扩增、在NCBI数据库中进行比对。结果表明:供试菌株的菌丝白色、细绒毛状,生长速度为(1. 6±0. 2) mm/d;子实体乳白色,伤后呈红棕色,菌盖表面局部覆有浅棕色细鳞片;随着子实体的成熟,菌褶颜色由肉粉到红棕、棕色,最后呈深褐色,孢子印为深褐色;单菇重40—70 g,生长周期50—55 d; ITS序列比对显示供试菌株与中国美味蘑菇的同源性为100%。     

辽宁地区辣椒疫病菌鉴定及同源性分析

对采集到的辣椒疫病病原菌通过形态学观察和rDNA-ITS序列分析进行鉴定及同源性研究。利用真菌通用引物ITS4、ITS5对病菌基因组进行PCR扩增,将测序结果与已知序列进行比对,并利用Clustalx1.83及MEGA4.0软件进行聚类分析。试验结果表明:病菌菌落为白色,菌丝呈鹅毛绒状,无隔膜,孢子囊卵圆形或梨形,乳突单生;测得病菌ITS序列为805～877bp,rDNA-ITS序列同源性高,致病菌病原均为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)。     

菠萝叶褐斑病菌的鉴定及其生物学特性

为明确菠萝(Ananas comosus)叶褐斑病的病原菌及其生物学特性,采用组织分离法、形态特征观察、致病性测定和rDNA ITS序列分析对病原菌进行鉴定.通过测定病原菌在不同条件下菌丝生长和孢子产生的情况,对病菌的生物学特性进行了研究.结果表明,菠萝叶褐斑病的病原菌为链格孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissler).燕麦琼脂和查氏琼脂培养基适宜病原菌菌丝的生长和产孢;麦芽糖、山梨醇,葡萄糖和蔗糖有利于菌丝生长,肌醇、木糖和麦芽糖有利于孢子产生.蛋白胨有利于菌丝生长,硝酸钾和牛肉膏有利于病原菌产孢;病原菌生长温度范围为5~34℃,最适生长温度为26℃;最适生长pH为7~8;光照可促进孢子的产生.     

一种红菜薹新病害的病原鉴定及生物学特性研究

2010-2011年在湖北省红菜薹(Brassica campestris L.ssp.chinensis L.var.utilis Tsen et Lee)栽培中发现一种新病害,并从该红菜薹新病害发病叶片分离得到了病原菌hctyk1,观察该病原菌的孢子形态,分析了病原菌的ITS序列,研究了病原菌的生物学特性。结果表明,该病原菌为链格孢[Alternaria alternata(Fr.:Fr.)Keissler],病原菌r DNA-ITS区序列已在Gen Bank上登录(登录号:JQ885954)。该菌菌丝生长致死温度为50℃;适宜pH为8;在供试的几种碳源、氮源中,最适的碳源是葡萄糖,最适的氮源是酵母浸出液。     

秋水仙素对“仲和红阳”猕猴桃诱变的影响

为明确菠萝(Ananas comosus)叶褐斑病的病原菌及其生物学特性,采用组织分离法、形态特征观察、致病性测定和rDNA ITS序列分析对病原菌进行鉴定.通过测定病原菌在不同条件下菌丝生长和孢子产生的情况,对病菌的生物学特性进行了研究.结果表明,菠萝叶褐斑病的病原菌为链格孢(Alternaria alternata(Fr.)Keissler).燕麦琼脂和查氏琼脂培养基适宜病原菌菌丝的生长和产孢;麦芽糖、山梨醇,葡萄糖和蔗糖有利于菌丝生长,肌醇、木糖和麦芽糖有利于孢子产生.蛋白胨有利于菌丝生长,硝酸钾和牛肉膏有利于病原菌产孢;病原菌生长温度范围为5~34℃,最适生长温度为26℃;最适生长pH为7~8;光照可促进孢子的产生.     

华南虎绦虫ITS及5.8S rDNA序列扩增与序列分析

以从广州动物园华南虎体内采集的2条绦虫作为研究对象,利用核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区序列(ITS)的遗传标记特点,用保守引物BD1和BD2对提取的DNA进行PCR扩增,经胶回收纯化后,连接到pGEM-T Easy载体上,然后转化并鉴定出阳性菌落,对菌落进行PCR扩增并测序,将测序结果与GenBank公布的相关绦虫ITS序列进行对比分析,结果显示,采自广州动物园华南虎的2条绦虫ITS及5.8S rDNA序列总长均为1387bp,序列相似性为100%,与猬迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)、舌形属绦虫(Diphyllobothrium ligula)、宽节双叶槽绦虫(Diphyllobothriumlatum)的ITS及5.8S rDNA序列相似性分别为96.7%、66.5%、71.5%,结果显示,此次分离的绦虫属于迭宫属的猬迭宫绦虫,所测得的华南虎猬迭宫绦虫的ITS序列为首次报道。     

10株镰刀菌rDNA内转录间隔区(ITS)序列分析

[目的]探索镰刀菌菌株间的系统发育关系。[方法]采用氯化苄法从分离的10株镰刀菌菌株中提取基因组DNA,对其内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增和序列测定。采用Blast方法将测序结果在GenBank中进行同源搜索,采用邻接法构建其与相关菌株的ITS序列系统发育树。[结果]供试菌株分别位于系统发育树的3个分支上,7株与腐皮镰刀菌为一个分支,序列相似性为98.61%~100%。菌株F94与尖孢镰刀菌为另一个分支,序列相似性为100%。菌株F83和F97与Fusarium incarnatum为另一个分支。各分枝内序列相似性均较高,为97.61%~100%,而不同分枝间菌株序列相似性较低。[结论]ITS序列系统发育分析可为镰刀菌属种的鉴定提供参考依据。