家蚕Osiris基因家族成员的系统进化与组织表达芯片分析

昆虫特有基因对于维持昆虫特有的形态、行为及生活习性起关键作用,同时也是防治有害昆虫的靶标基因。基于家蚕基因组数据,对昆虫特有基因Osiris(Osi)家族进行了分析。通过同源比对,发现家蚕的Osi家族含有22个成员,其中21个基因串联分布在26号染色体,1个基因位于4号染色体。共线性分析发现,家蚕与黑腹果蝇有18个Osi基因表现为共线性关系。系统进化分析表明Osi基因家族是在昆虫物种分化前已形成的多基因家族,家蚕与果蝇的Osi家族亲缘关系相对较近。家蚕的4个Osi基因(BmOsi9-1、BmOsi9-3、BmOsi9-4和BmOsi9-5)聚成一个进化枝,且在基因组上呈串联分布,暗示其是在物种分化后通过基因复制产生的,属特有基因。结构域分析发现,家蚕Osi蛋白均含有一个功能未知的结构域DUF1676,是Osi基因家族的典型特征。组织芯片分析表明,BmOsi20和BmOsi17分别在家蚕5龄幼虫的中肠和精巢中特异性高量表达,BmO-si18和BmOsi9-1分别在马氏管和丝腺中特异表达。     

过表达和干扰GDF9基因对番鸭颗粒细胞凋亡和周期的影响

实验旨在探究生长分化因子9(Growth Differentiation Factor,GDF9)基因对番鸭颗粒细胞的影响，本研究构建了GDF9过表达载体（pEX-2-GDF9）以及干扰GDF9小RNA (siRNA-GDF9-530、siRNAGDF9-978、siRNA-GDF9-1320)，分别转染至原代番鸭颗粒细胞内，通过流式细胞术检测GDF9基因对细胞周期和凋亡的影响；荧光定量PCR技术检测转染后颗粒细胞周期和凋亡相关基因的表达量。结果显示，过表达GDF9基因将番鸭颗粒细胞阻滞在G0/G1期，S期细胞极显著减少，且Bax基因和Caspase-3基因表达量极显著（或显著）上调，说明过表达GDF9促进了颗粒细胞凋亡；干扰GDF9基因表达后，G0/G1期细胞极显著减少，S期细胞极显著增加，且CDK-2、Bcl-2、CCND1 mRNA极显著上调，CCNE1 mRNA显著上调。综上可知，GDF9基因表达促进颗粒细胞凋亡、抑制细胞周期进程。该结果可为番鸭的卵泡发育机制研究提供理论基础。     

miR-92a对奶山羊乳腺上皮细胞增殖及凋亡的调控分析

miRNAs是对哺乳动物乳腺组织发育及泌乳机能进行调控的重要因子。本研究依据已有的关中奶山羊乳腺组织miRNA表达谱,选择不同泌乳时期差异表达的miR-92a为研究对象,探究miR-92a对山羊乳腺上皮细胞（GMEC）增殖及凋亡的调控作用,并挖掘其潜在的调控基因。采用荧光定量PCR、MTT检测、EdU检测及流式细胞术,检测miR-92a在不同泌乳时期乳腺组织的表达情况,并在细胞水平检测miR-92a对乳腺上皮细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控作用。利用RNA-seq技术,分析过表达miR-92a乳腺上皮细胞中的差异表达基因。qRT-PCR结果显示,miR-92a在奶山羊泌乳初期乳腺组织中表达量极显著高于泌乳中期（P<0.01）,表明miR-92a可能对奶山羊泌乳性状有重要的调控作用。GMEC过表达miR-92a后,试验结果显示：与NC对照组比较,miR-92a过表达组的EdU阳性细胞数极显著减少（P<0.01）,S期的细胞数显著下降、G1期的细胞数显著增加,同时miR-92a组的凋亡细胞数目显著增加（P<0.05）。采用RNA-seq,构建了miR-92a过表达mRNA文库,发现下调基因54个,上调基因160个。GO terms及KEGG通路分析显示差异表达基因调控乳腺上皮细胞多种生物学功能。以上结果表明miR-92a促进GMEC凋亡、抑制其增殖,测序结果进一步证明miR-92a对奶山羊乳腺发育及泌乳性能具有潜在的调控作用。     

miR-92a对奶山羊乳腺上皮细胞增殖及凋亡的调控分析

miRNAs是对哺乳动物乳腺组织发育及泌乳机能进行调控的重要因子。本研究依据已有的关中奶山羊乳腺组织miRNA表达谱,选择不同泌乳时期差异表达的miR-92a为研究对象,探究miR-92a对山羊乳腺上皮细胞(GMEC)增殖及凋亡的调控作用,并挖掘其潜在的调控基因。采用荧光定量PCR、MTT检测、EdU检测及流式细胞术,检测miR-92a在不同泌乳时期乳腺组织的表达情况,并在细胞水平检测miR-92a对乳腺上皮细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控作用。利用RNA-seq技术,分析过表达miR-92a乳腺上皮细胞中的差异表达基因。qRT-PCR结果显示,miR-92a在奶山羊泌乳初期乳腺组织中表达量极显著高于泌乳中期(P0.01),表明miR-92a可能对奶山羊泌乳性状有重要的调控作用。GMEC过表达miR-92a后,试验结果显示:与NC对照组比较,miR-92a过表达组的EdU阳性细胞数极显著减少(P0.01),S期的细胞数显著下降、G1期的细胞数显著增加,同时miR-92a组的凋亡细胞数目显著增加(P0.05)。采用RNA-seq,构建了miR-92a过表达mRNA文库,发现下调基因54个,上调基因160个。GO terms及KEGG通路分析显示差异表达基因调控乳腺上皮细胞多种生物学功能。以上结果表明miR-92a促进GMEC凋亡、抑制其增殖,测序结果进一步证明miR-92a对奶山羊乳腺发育及泌乳性能具有潜在的调控作用。     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

鸡TGFβ1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响

旨在探讨鸡TGFβ1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。作者将构建的鸡TGFβ1过表达载体、干扰表达载体以及相应阴性对照转染MDCC-MSB1细胞,然后检测转染后各组细胞鸡TGFβ1的表达水平、细胞增殖能力、细胞周期与凋亡,细胞的迁移与侵袭能力。结果显示,与相应阴性对照相比,转染TGFβ1过表达质粒可显著上调MDCC-MSB1细胞的TGFβ1表达水平,显著抑制MDCC-MSB1细胞的增殖,且使G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时增加细胞凋亡率,降低细胞的迁移与侵袭能力;转染TGFβ1干扰表达质粒可显著下调MDCC-MSB1细胞的TGFβ1表达水平,显著促进MDCC-MSB1细胞的增殖,G1期细胞减少、S和G2期细胞增加,同时降低细胞凋亡率,增加细胞的迁移与侵袭能力。结果表明,鸡TGFβ1可抑制MDCC-MSB1细胞增殖、迁移与侵袭,促进其凋亡。     

Sf9细胞PHB2蛋白的原核表达及其抗血清的制备

为了研究Sf9细胞PHB2蛋白(Sf-PHB2)的功能及其对虾白斑综合症病毒(WSSV)极早期基因ie1的转录调控作用,本研究从昆虫细胞Sf9中扩增sf-phb2基因编码区,克隆至表达载体pET30a中,转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达6His-Sf-PHB2重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达的重组蛋白以...     

ACSL1基因对绵羊脂肪代谢的影响

为了深入了解绵羊长链脂酰辅酶A合成酶1(long-chain fatty acyl-CoA 1,ACSL1)对脂肪代谢的调控机制,本研究利用脂质体介导转染ACSL1基因过表达载体及干扰载体到前体脂肪细胞中,经过G418筛选获得转基因细胞,利用荧光定量PCR检测绵羊ACSL1mRNA水平变化,结果发现过表达载体和RNA干涉载体Ⅰ可有效对ACSL1基因进行转录和调控。检测过表达、沉默ACSL1基因后以及未转染的细胞中甘油三酯含量的变化,结果 ACSL1基因过表达后可显著提高绵羊前脂肪细胞的甘油三酯的含量,抑制ACSL1表达后也显著降低了甘油三酯的含量;表明ACSL1基因可能在调节动物脂肪代谢中起关键作用。     

鸡p15因子抑制MDCC-MSB1细胞的增殖及端粒酶活性

为探讨鸡p15基因的生物学功能,试验构建了鸡p15基因的真核表达载体pcDNA3.1( )-p15,并转染到鸡MDV转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1,应用G418筛选掉未转染的细胞,对存活细胞p15蛋白的表达、细胞增殖力、群体倍增时间、细胞周期和端粒酶的活性进行了检测。结果表明,与转染空质粒pcDNA3.1( )细胞相比,转染了p15基因的细胞稳定表达了p15蛋白;细胞的增殖受到了抑制,抑制率达45%～74%;群体倍增时间从27h延长至416h;流式细胞仪分析细胞周期发现,p15蛋白引起了细胞多停滞于G0/G1期,S和G2/M期细胞比例下降;端粒酶活性受到抑制。     

鸡白介素8的克隆表达及其生物趋化性研究

鸡白介素8(cIL8)是9E3/CEF4基因编码的一种诱导型趋化因子。用RT-PCR方法,从鸡胚胚体总RNA模板中扩增cIL8的cDNA序列,测序后,将cIL8基因分别克隆入pGEX-6p-1载体和pFastBacI载体进行表达。利用SDS电泳分离原核表达的cIL8融合蛋白,制备鼠抗cIL8血清,并与昆虫细胞表达的cIL8进行免疫荧光(IFA)反应,同时对雏鸡外周血单个核细胞(PBMC)进行生物趋化试验。结果成功扩增了cIL8基因的cDNA序列,在大肠杆菌和昆虫细胞中均能表达,制备的鼠抗cIL8血清能与昆虫细胞表达的cIL8反应。重组cIL8在一定浓度范围内,可使PBMC发生趋化作用,最高趋化指数为4.38±0.49,且是典型剂量依赖的钟形趋化性反应曲线。本研究结果为cIL8的功能研究和探讨马立克氏病病毒类白介素8(vIL8)的生物学作用奠定了基础。     

IHH过表达对鸡原代软骨细胞增殖和分化的影响

为探究印度刺猬因子(IHH)基因对鸡原代软骨细胞增殖和分化的调控作用，本研究根据IHH基因序列信息，构建真核过表达载体(OV-IHH);采用双酶切和测序进行鉴定，并将其转染鸡原代软骨细胞；采用CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，对软骨细胞进行成骨诱导分化至21 d,采用ALP试剂盒检测细胞ALP活性。结果表明，IHH真核过表达载体构建成功，与对照组和空载体组(OV-NC)相比，过表达组IHH基因的mRNA表达显著增加(P<0.01),过表达效率扩大2 700倍左右。过表达IHH促进细胞周期从G1期到S期的转换，从而促进增殖，抑制细胞凋亡，且ALP活性升高，促进细胞分化。综上，IHH基因显著影响鸡软骨细胞的生长发育，研究结果为进一步解析IHH基因调控鸡匍匐性状的作用机制提供理论依据。     

miR-139对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡调控的初步研究

支持细胞的增殖力决定性成熟后睾丸支持细胞的数量,进而影响公猪的精子发育、成熟及精液品质。microRNA通过结合靶基因的3′-UTR,广泛参与调控支持细胞增殖、凋亡和分化等多种生物学过程。为了研究miR-139在猪未成熟支持细胞中的作用,试验将miR-139过表达试剂、抑制表达试剂及真核翻译起始因子(EIF4G2)的干扰试剂分别转染到猪的未成熟支持细胞中,采用实时荧光定量及流式细胞术等方法对其进行研究。结果显示：过表达miR-139,细胞周期进程加快,增殖能力显著增强,而细胞凋亡率则显著降低;抑制表达miR-139后,结果与之相反。干扰EIF4G2基因后,细胞周期进程加快,且促进了细胞增殖而抑制其凋亡,与过表达miR-139的结果相一致。结果说明miR-139促进猪未成熟支持细胞增殖而抑制其凋亡,且其作用机制可能是通过靶向EIF4G2基因实现。该研究为进一步探讨支持细胞增殖对精子发生的作用提供理论依据。     

鸡MyD88基因对巨噬细胞增殖和凋亡的影响

为探究鸡MyD88基因对巨噬细胞增殖和凋亡的影响，通过构建MyD88基因过表达质粒，以及合成MyD88基因干扰片段，并分别转染至鸡巨噬细胞(HD11)细胞中，采用CCK-8、流式细胞术及qRT-PCR方法检测过表达和干扰MyD88对HD11细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，MyD88过表达可显著降低HD11细胞活力(P<0.05),下调促增殖标志基因CCND1和PCNA的表达水平(P<0.05),上调抑增殖标志基因P21的表达水平(P<0.05),减少S期细胞数，阻滞细胞周期进程，增加HD11细胞凋亡率，上调促凋亡基因Caspase 3、Caspase 9和Bax的表达水平(P<0.05)。干扰MyD88可显著提高HD11细胞活力(P<0.05),上调促增殖标志基因的表达水平，降低G1期细胞数，增加S期细胞数，加快细胞周期进程，降低HD11细胞凋亡率。结果表明，MyD88基因能抑制HD11细胞增殖，促进HD11细胞凋亡。     

河流型水牛TGF-β基因家族鉴定及其胚胎发育早期的表达分析

本研究旨在鉴定河流型水牛中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)基因家族成员,分析该家族成员在胚胎发育早期的表达情况,并讨论其可能的作用。根据人类中已鉴定的TGF-β基因家族信息,通过BLASTP在河流型水牛全基因组层面鉴定TGF-β家族成员,同时对牛、山羊和小鼠的TGF-β家族信息进行鉴定,结合5个物种中的TGF-β基因家族信息构建系统进化树。根据河流型水牛胚胎发育早期4个阶段(2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚期)的RNA-seq数据分析,通过FPKM(Fragment of Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)值计算TGF-β家族成员的表达情况。结果显示,根据人类中的33个TGF-β基因,分别在河流型水牛、牛、山羊和小鼠的基因组中鉴定出32、23、32和26个TGF-β基因,几个物种中TGF-β基因家族成员数量相近且在系统进化树中分布均匀,说明该家族在各个物种中具有分布和功能的保守性。在河流型水牛的32个TGF-β基因中,21个TGF-β基因家族成员在胚胎发育早期不表达或极低剂量表达,6个分化抑制因子低剂量表达,5个高表达的TGF-β基因均有报道过与繁殖过程相关,说明在河流型水牛的胚胎发育早期只有部分成员(5/32)参与其中行使功能,绝大多数的TGF-β基因(27/32)并没有参与其中。本研究结果为河流型水牛中TGF-β基因家族研究提供了数据基础,并为TGF-β基因家族在胚胎发育早期的功能研究提供了理论依据。     

爱普里诺霉素对N2a细胞增殖的影响

阿维菌素类药物是大环内酯类化合物,被广泛用于人和动物的抗寄生虫药物。爱普里诺霉素(eprinomycin,EPR)属于AVMs家族。论文检测了EPR对细胞的增殖、存活和细胞周期的影响。结果发现,EPR都能显著抑制神经细胞鼠成神经瘤细胞N2a的增殖,并呈浓度相关性,EPR可使N2a细胞周期阻滞在G1期和G2期,但未发现明显的细胞凋亡。     

牛IRF7蛋白对牛病毒性腹泻病毒增殖影响的研究

为了探索牛干扰素转录调节因子7(IRF7)基因对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)增殖的影响,试验通过慢病毒包装和RNA干扰等试验构建IRF7基因的干扰和过表达细胞模型,然后运用实时荧光定量PCR扩增和Western-blot验证过表达及干扰效果,最后用BVDV进行感染,通过E2蛋白的表达水平评估IRF7基因与BVDV增殖的关系。结果表明：BVDV感染IRF7基因过表达细胞模型12 h后,E2基因相对表达量显著降低(P<0.05),且随着时间的延长,E2蛋白表达水平逐渐降低;而BVDV感染IRF7基因干扰细胞模型8 h后,E2基因相对表达量显著升高(P<0.05),E2蛋白的表达水平在8 h后逐渐升高,即过表达IRF7基因能够使BVDV增殖水平降低,而干扰IRF7基因的表达则能够使BVDV的增殖水平增加。说明牛IRF7蛋白对牛BVDV的增殖具有抑制作用。     

密码子优化的鸡白细胞介素-17在昆虫细胞中的表达研究

为了获得具有良好生物学活性且具有较高表达量的鸡白细胞介素-17(ChIL-17),本研究在前期研究工作基础上,将ChIL-17的编码基因按照真核细胞(昆虫细胞)偏爱的密码子进行优化改造,经全基因合成后插入到转座载体pFastBacTM Ⅰ中,构建重组转移质粒pfast-mod.ChIL-17并转化DH10Bac感受态细胞.通过位点特异性转座将mod.ChIL-17基因整合到穿梭质粒Bacmid中,获得重组穿梭质粒Bacmid-mod.ChIL-17.应用脂质体将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-mod.ChIL-17.重组病毒传代扩增感染Sf9细胞,通过间接免疫荧光检测目的蛋白的表达.结果表明,经过优化的ChIL-17在杆状病毒系统中获得表达.     

猪IL-2成熟蛋白在昆虫细胞中的表达及生物学活性鉴定

以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增猪IL-2成熟蛋白基因。将猪IL-2成熟蛋白基因定向克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual中,转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2,转染昆虫细胞。间接免疫荧光试验表明重组猪IL-2在Sf9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为20000的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,重组猪IL-2经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,重组猪IL-2在昆虫细胞中得到表达,表达的重组蛋白具有一定生物学活性,为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。     

RNA干扰水牛MTPN基因对颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低MTPN基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖、凋亡及雌激素、孕酮分泌的影响。应用RNAi技术敲低颗粒细胞中MTPN基因的表达水平,通过实时荧光定量PCR方法检测体外培养水牛颗粒细胞中MTPN基因及增殖和周期相关基因的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖,借助流式细胞仪检测细胞周期的分布,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中雌激素与孕酮含量。结果显示,经siRNA(si-MTPN)转染颗粒细胞后,MTPN基因相对表达量下降60%(P0.01);细胞增殖受到显著抑制(P0.05),G1期细胞数量下降,S期细胞数量上升,G2期细胞数量极显著上升(P0.01),细胞被阻滞在G2期;增殖与周期相关基因Cyclin D2、Cytochrom C表达量显著上升(P0.05),Caspase9、Fas基因表达量极显著上升(P0.01);ELISA检测雌激素和孕酮分泌水平均显著下降(P0.05)。综上表明,敲低MTPN基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养水牛颗粒细胞的增殖及雌激素、孕酮的分泌水平,为阐明MTPN基因参与家畜卵泡发生的分子机制提供参考。     

猪TRIM11基因克隆及其促进猪伪狂犬病毒在体外增殖的研究

为初步研究猪TRIM11的免疫学功能,以猪颌下淋巴结cDNA为模板扩增TRIM11基因cDNA并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析,将该基因与PiggyBac载体相连获得真核表达载体PB-TRIM11,之后转染PK15细胞获得稳定表达细胞系。用猪伪狂犬病毒(PRV)刺激过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞后,于不同时间收获细胞上清,比较两组细胞上清中病毒滴度变化。结果表明,猪TRIM11的ORF长度为1 407bp,编码468个氨基酸,该氨基酸序列含有3个TRIM家族保守的结构域。组织表达谱分析显示,猪TRIM11在脂肪组织、肺的表达量较高,而在心、回肠、十二指肠、直肠中的转录量较低。成功克隆了猪TRIM11cDNA序列并构建了真核转录载体PB-TRIM11,qRT-PCR检测结果表明TRIM11在PK15细胞系中成功表达。检测感染PRV后过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞上清液病毒的TCID50发现过表达TRIM11组的病毒滴度始终高于对照组。过表达TRIM11有一定的促进PRV增殖的作用,为进一步研究猪TRIM11在天然免疫中的作用奠定了基础。