斑马鱼微卫星分子标记检测鲤鱼种间多态性

用6072对斑马鱼（Danio rerio）微卫星引物对黑龙江鲤（Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel）、荷包红鲤（Cyprinus carpio var．wuyuanensis）和柏氏鲤（Cyprinus pellegrini Tchang）进行种间遗传差异分析，共发现563个斑马鱼微卫星标记在鲤鱼种间表现出多态性。从中随机抽选25个标记，对斑马伍和3种鲤鱼的遗传多样性进行分析，使用Phylip3．63软件按照Nei氏标准遗传距离计算种间遗传距离，再用MEGA3．0软件绘制NJ系统发生树，并进行1000次bootstrap检验系统树。结果显示，黑龙江鲤与荷包红鲤首先聚类，然后是柏氏鲤、斑马鱼。这些具有多态性的斑马鱼微卫星标记可用于鲤鱼种间种质鉴定，同时，借用模式生物斑马鱼的丰富遗传标记资源，增加同科的鲤鱼遗传连锁图谱上遗传标记的密度，必将对鲤鱼遗传育种进入分子育种时代起到促进作用。     

微卫星标记及其在鱼类原种检测中的应用

我国拥有多达3000余种鱼类,其中淡水鱼类有800多种,分属于13目38科226属[1].此外,近30多年来,从国外引进的鱼类约有40多种.这些物种无论在形态方面,还是在生物学特性、栖息环境方面,多样性都极其丰富.但随着人工养殖规模得逐渐扩大,鱼类原种受水体污染、自然生态环境破坏和水利工程等因素的影响,导致鱼类原种种质资源逐渐退化[2].因此,开展鱼类原种保存对提高养殖产量有着十分重要的意义.     

荧光标记微卫星技术用于凡纳滨对虾不同家系亲权关系鉴定

应用荧光标记微卫星技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)家系进行亲权鉴定。挑选14个多态信息含量较高的微卫星位点,以人工选育建立的凡纳滨对虾5个全同胞家系为试验材料,采用Cervus 3.0进行亲权分析,并根据家系内个体间的遗传距离进行UPGMA聚类分析。结果表明,14个微卫星位点的平均等位基因数为6,平均多态信息含量为0.6896,平均期望杂合度为0.7309,平均观测杂合度为0.7661,第一亲本、第二亲本和双亲的累计排除率分别为0.99721733、0.99996559和0.99999997;进一步模拟分析表明,要达到亲权鉴定的要求,在双亲性别已知时至少需要5个微卫星位点,双亲性别未知时至少需要6个微卫星位点;模拟分析及试验验证所选用的14个微卫星位点最多可以鉴定1 954个已知性别的亲本或1 203个未知性别的亲本。所选用的14个微卫星标记可在生产及科研试验中用于获取凡纳滨对虾系谱信息。     

中华绒螯蟹可视荧光标记应用研究

采用红色可视嵌入性荧光(visible implant elastomer,VIE)标记中华绒螯蟹(Eriocheir Sinensis),观察了荧光标记在中华绒螯蟹中的保持率和对其存活、生长、发育及繁殖的影响。荧光标记幼蟹不同部位在室内饲养并观察8周,结果表明,在中华绒螯蟹幼蟹不同部位的标记保持率均为100%,对照组和各试验组幼蟹的存活率无显著性差异(P0.05)。荧光标记幼蟹螯掌节和腕节间的关节膜后移入室外养殖池养殖,中华绒螯蟹室外养殖的生长和发育速度与对照组也无显著差异(P0.05)。挑选标记后经室外池塘养成的中华绒螯蟹进行小水体繁育实验,抱卵率为83.3%,平均抱卵量30×104egg·ind-1,与未标记中华绒螯蟹小水体繁育实验结果比较,抱卵率、平均抱卵量无显著性差异,荧光标记不影响中华绒螯蟹交配抱卵。本文结果表明,VIE可视荧光标记可作为中华绒螯蟹个体识别标记,应用于育种、资源调查等研究和生产实践。     

大黄鱼微卫星标记引物在石首鱼科几个近缘种中的通用性研究

本研究分析了8对大黄鱼（Pseudosciaena crocea）微卫星标记引物在石首鱼科5个亚科8属10个种中的通用性。结果表明,大黄鱼微卫星标记引物在黄鱼亚科鱼类中有较高的通用性,其中位点PC1C4,PC4H12,PC5E11,PC8F5,PC10F10,PC10G6的引物可在小黄鱼（P.polyactis）和棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）中获得清晰扩增条带,位点PC7H4引物也可在小黄鱼中扩增,上述可扩增位点在两个种中均得到多个等位基因,表现出较高的多态性;大黄鱼微卫星标记引物在白姑鱼亚科、叫姑鱼亚科、牙[鱼或]亚科及石首鱼亚科鱼类中也有较高的通用性,其中在银牙[鱼或]（Otolithes argenteus）中得到6个可扩增位点（PC1C4,PC4H12,PC7A2,PC7H4,PC10F10,PC10G6）,在鮸状黄姑鱼（Nibea miichthioides）、丁氏[鱼或]（Wak tingi）和眼斑拟石首鱼（Sciaenops ocellatus）中各得到5个可扩增位点,在浅色黄姑鱼（N.Chui）和尖头黄鳍牙[鱼或]（Chrysochir aureus）中各得到4个可扩增位点,在皮氏叫姑鱼（Johnius belengerii）中得到3个可扩增位点（PC7H4,PC10F10,PC10G6）。位点PC10F10和PC10G6引物在10个种中都可得到清晰的扩增产物,可作为10种石首鱼的通用标记。引物PC5E11和PC8F5只在黄鱼亚科中得到扩增产物,为黄鱼亚科特异性标记。[中国水产科学,2008,15（2）：237-243]     

异硫氰酸荧光素标记鳗弧菌条件优化及应用条件对荧光信号的影响

为了实现对目标细菌的有效示踪,实验以异硫氰酸荧光素(FITC)为标记物,分别设置FITC标记浓度0.2、2、20、50、100、200μg/mL,标记时间1、15、30、60、120、240 min,研究了FITC标记浓度与标记时间对鳗弧菌标记效果的影响,同时对在不同温度(25、4、-20、-70℃)及不同时间(24、48、96、192 h)存储条件下鳗弧菌标记荧光的稳定性进行了比较,对标记鳗弧菌经甲醛灭活后的荧光变化进行了观察,研究了不同光照条件(0、150、1 500、25 000 lx)对标记鳗弧菌的荧光衰减影响,以及在-20和-70℃条件下反复冻融对标记鳗弧菌荧光强度的影响。结果表明,FITC的最适标记浓度范围为20~100μg/mL,最适标记时间范围60~120 min,储藏在-20和-70℃条件下,标记后的鳗弧菌荧光信号比储藏在4和25℃条件下稳定,标记后的鳗弧菌经甲醛灭活后的荧光信号稳定性优于对照组,不同强度自然光照对标记鳗弧菌的荧光衰减效果不明显,标记细菌经3次冻融,发现在-70℃条件下冻存的细菌荧光信号稳定性保持良好。本研究结果为FITC用于标记海洋细菌提供了实用的技术参数。     

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)Vtg基因实时荧光定量PCR分析的引物设计与评估

为应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)基因的组织表达谱,利用Primer5.0软件设计了扩增红鳍东方鲀Vtg基因片段的引物并进行了qPCR评估。结果显示:引物对VtgF-VtgR在qPCR扩增时,熔解曲线为单一尖锐峰;标准曲线分析显示:引物的扩增效率为105.32%,R^2值为0.999。上述结果说明该对引物具有良好的扩增特异性和扩增效率,满足了qPCR扩增的要求。     

牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180CFU/mL.同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%.结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PcR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测.     

基于RAD测序技术的瓦氏黄颡鱼 (Pelteobagrus vachellii)微卫星标记的开发

采用RAD测序技术对瓦氏黄颡鱼进行简化基因组测序,利用MISA软件对拼接的数据进行SSR搜索.结果共获得2275778条contig序列,共检测到466983个SSR位点,其中二碱基重复位点最多,有335095个,占总数的71.8％.随机挑选碱基重复次数较多的微卫星引物25对进行合成,有19对引物通过PCR扩增可以获得...     

利用GoldenGate分析的高通量SNP芯片对鲤基因进行分型

单核苷酸多态性(SNPs)标记在大多数物种基因组中数量巨大且分布均匀,是许多水产物种遗传研究的理想标记,因此快速发展了几种高通量、快速的SNP标记分型平台。本研究利用Golden Gate分析技术对鲤Cyprinus carpio转录组测序的1 536个SNP标记合成了一张中等密度SNP芯片,对5个鲤群体的480份样本进行基因分型。结果表明:1 235个SNP标记成功分型,约占80%;915个标记至少在一个家系中呈现多态性,占74.1%;标记最小等位基因频率(MAF)介于0.05~0.5之间,平均为0.334,其中48.9%的标记最小等位基因频率(MAF)大于平均值;5个群体中SNP标记平均多态性信息含量(PIC)在0.3左右,为中度多态,杂合度为0.010~0.990,平均为0.5左右,暗示群体具有丰富的遗传多态性,育种价值及性状改良潜力很大。本研究分型的多态性SNP标记可广泛应用于遗传多样性研究、标记-性状关联分析以及分子标记辅助育种。     

利用微卫星标记高效鉴定松浦镜鲤的亲缘关系

用37尾雌和14尾雄松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu构建37个血统明确的全同胞家系,同池、同条件养殖。用筛选出的9个多态性微卫星标记和建立的多重PCR检测方法进行子代群体(1 318尾)的亲权鉴定。9个位点共检测到53个等位基因,各位点均为高度多态(PIC0.5),平均期望杂合度为0.742,观测杂合度为0.755。亲本基因型信息的模拟分析显示,利用9个标记将子代分配到亲本对的成功率可达100%。实际鉴定结果:1 287尾个体准确鉴定到配组的亲本对,鉴定成功率为97.6%。以上结果表明:本研究提供的标记和检测方法可用于松浦镜鲤的亲本遗传距离分析和家系亲缘追溯,也适用于群体遗传多样性监测。     

性状相关微卫星标记分析黄河鲤群体的遗传潜力

利用21个微卫星标记分析一个黄河鲤繁殖群体,以检测其遗传潜力及与生长性状(体重、全长、体长等)相关的标记。共检测到122个等位基因,等位基因数为2~10,平均有效等位基因数为3.3706,平均观察杂合度为0.5893,平均期望杂合度为0.6578,平均多态信息含量为0.6108,分析结果表明:该群体的多样性水平较高。经X2检验,群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。有8个标记分别与体重、全长、体长、体高等性状具有显著相关性。其中,标记CAFS2203与体厚、头宽、尾柄长呈极显著相关(P0.01),标记CAFS1603与吻长极显著相关(P0.01),标记CAFS1639与尾柄高极显著相关(P0.01)。本研究结果可以为黄河鲤的分子育种与选育提供参考。     

Effect of Different Thawing Methods and Multiple Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Common Carp (Cyprinus carpio)

The effect of different thawing methods—running water, microwave, slack water (25°C), air (25°C), and refrigerator (4°C)—and multiple freeze-thaw cycles (0, 1, 3, and 5) on the quality of common carp were investigated. Microwave thawing showed the lowest score for sensory assessment and the highest cooking loss (p < 0.05), while 4°C refrigerator thawing showed less thawing loss and cooking loss but required the longest thawing time. Ca²⁺-ATPase activity and sulfhydryl content of air thawing were lower (p < 0.05), while no significant differences were observed among other thawing methods. Water loss and the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) value increased (p < 0.05) when freeze-thaw cycles increased. The sensory scores and hardness decreased significantly when the freeze-thaw cycles increased (p < 0.05). A significant decrease (p < 0.05) was observed in salt-extractable protein content after five freeze-thaw cycles. Different thawing methods affected the quality of common carp. Frozen common carp subjected to freeze-thaw cycles resulted in accelerated lipid and protein oxidation and caused mechanical damage to muscle tissues.     

黄河鲤肾脏的显微和亚显微结构观察

应用常规解剖学和组织学方法在光镜和电镜下观察成体黄河鲤肾脏的显微和亚显微结构.试验结果显示,黄河鲤的肾脏包括头肾和中肾两部分.头肾实质中没有肾单位,主要由造血组织和淋巴组织构成,可观察到黑色素巨噬细胞中心和甲状腺滤泡;中肾实质中包含有肾小体、肾小管和拟淋巴组织,肾小体由鲍曼氏囊和与其相接触的血管球组成.肾小管由颈段、第...     

锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA, 是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验。在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下, 取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤, 并达到研究相关基因表达的目的。本研究利用TR izo l法提取RNA, 获得的各样品RNA条带完整、纯度高。结果表明, 4 种保护性组织提取的RNA 经过逆转录反应, 得到了高质量的CDNA。内标基因( B- actin)、热激蛋白基因( hsp70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带, 通过NCB I数据上的BLAST比对证明, 各序列的同源性在95%以上。利用本研究的方法, 可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性, 用于进一步的分子生物学研究。     

鲤耐低温候选基因CcSCD全长cDNA的克隆及功能预测

硬酯酰辅酶A脱氢酶(Stearoyl-CoA Desaturase,SCD)是参与脂肪酸脱氢反应的限速酶和关键酶,此酶编码基因SCD对增加膜磷脂的不饱和脂肪酸成分,提高细胞膜在低温下的流动性发挥重要作用,可能是抗寒过程中的关键基因成员。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplifications of cDNAEnds,RACE)克隆了鲤(Cyprinus carpio)脑组织CcSCD基因的全长cDNA序列,采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在低温(6℃)和常温(23℃)条件下的转录表达差异,对其蛋白编码序列的结构和功能进行了预测分析。结果显示,CcSCD基因cDNA全长2618bp,包含一个由324个氨基酸残基组成的长度为975bp的阅读框(ORF);蛋白分子进化树显示鲤的SCD和草鱼(Ctenopharyngodon idella)的SCD蛋白同源性最高,相似性达88%;实时荧光定量结果表明,低温刺激下(6℃),CcSCD基因表达水平是常温条件下(23℃)的13.9倍,差异非常显著(P0.01)。本研究旨在为今后构建表达载体,通过遗传操作等研究手段鉴定其抗寒功能奠定基础。     

鲤低氧适应性状的全基因组关联分析

低氧适应是水产养殖物种的重要性状,筛选用于改良低氧适应性状的分子标记及候选基因有助于鱼类耐低氧品种选育.在数量性状和质量性状的遗传研究中,全基因组关联分析(GWAS)广泛应用于性状相关标记和基因的发掘.本研究对鲤(Cyprinus carpio)养殖群体开展了低氧胁迫实验,选取了低氧敏感和低氧耐受的极端性状个体作为研究...     

滇池鲤4种年龄鉴定材料的比较

为确定鉴定滇池鲤（Cyprinus carpio）年龄的适宜材料,对4种年龄鉴定材料（耳石、鳞片、胸鳍条和鳃盖骨）的形态和年轮标志进行了描述,并对这4种钙化组织鉴定鲤年龄的一致性进行了探讨。2013年5、6、8-11月以及2014年3-7月,使用拖网采集云南滇池鲤584尾,体长范围7.5~50.5 cm,体重范围17.2~3 211.3 g。其中耳石采集于584尾样本,鳃盖骨和鳞片分别采集于276尾样本,胸鳍条采集于274尾样本。微耳石磨片轮纹清晰,在反射光下呈明暗相间的条纹,年龄标志明显。同一鉴定者2次年龄读数的吻合率,微耳石磨片轮最高（88.0%),鳞片次之(84.1%),胸鳍条和鳃盖骨则分别为73.7%和72.1%。2次读龄的平均误差百分比,微耳石磨片和鳞片较小,分别为2.6%和2.9%;胸鳍条和鳃盖骨较高,分别为4.7%和5.9%。以微耳石磨片年龄读数为基准,鳞片年龄读数与其吻合率最高(77.5%),平均变异系数最低(6.14%);鳃盖骨和胸鳍条与其吻合率分别为61.9%和56.2%,平均变异系数均超过12%。综合分析认为,耳石是滇池鲤年龄鉴定的最佳材料,鉴定4龄以下个体年龄时可使用鳞片,鳃盖骨和胸鳍条则不适于滇池鲤的年龄鉴定。     

Evaluation of the Antioxidant Activity In Vitro and in Hippocampal HT-22 Cells System of Protein Hydrolysates of Common Carp (Cyprinus carpio) By-Product

Fish processing by-products may become more than 50% of the starting material. If mismanaged, these large quantities of discarded fish can create serious pollution problems and can also generate cost associated with their disposal. Enzymatic hydrolysis is one of the techniques that is currently being developed in order to recover and add value to these biomolecules. There is an increasing interest in natural antioxidants that are safer for consumers compared with synthetic antioxidants. In this study, common carp by-product was hydrolyzed using the enzymes Alcalase (A) and Protamex (P) to reach degrees of hydrolysis (DH) of 10 and 15%, respectively. Antioxidant capacity against peroxyl radicals (ACAP); 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging; and the measurement of intracellular reactive oxygen species (ROS) concentration after exposure to common carp protein hydrolysates were investigated. The results revealed that the hydrolysate A15 exhibited significantly (p < 0.05) higher antioxidant activity against the DPPH radical. A15 showed the highest in vitro antioxidant competence against peroxyl radicals, whereas P15 showed the lowest activity against peroxyl radicals (p < 0.05). Hydrolysates having the highest and the lowest in vitro antioxidant activity (A15 and P15, respectively) were selected for the determination of antioxidant activity in the HT-22 cells system. Measurement of intracellular ROS concentration revealed that P15 at the concentration of 1.25 mg/mL significantly (p < 0.05) reduced the intracellular ROS concentration. These results showed that common carp by-product protein hydrolysates are a source of antioxidant peptides with a high potential for food and pharmaceutical industries to develop new nutraceuticals and functional foods.