鸡免疫球蛋白(GIgG)轻链的分离纯化及其抗血清的制备

经硫酸铵盐析、柱色谱分离得到纯化的鸡血清IgG。继用2-巯基乙醇还原、碘乙酰胶烷化拆开IgG的轻、重链,再经Sephadex G100凝胶过滤柱色谱分离得到IgG轻链。以IgG轻链免疫家兔制得兔抗鸡IgG轻链抗血清。     

鸡免疫球蛋白G Fc(IgG Fc)片段的分离纯化及其抗血清的制备 Ⅱ.豚鼠抗鸡IgG Fc片段血清的制备

经硫酸铵盐析、DEAE 32-纤维素和Sephadex G 200柱色谱法分离得到纯化的鸡血清IgG。然后用木瓜蛋白酶水解IgG,再经DEAE 32-纤维素柱色谱纯化制得IgG Fc片段,并以IgG Fc片段免疫豚鼠制备豚鼠抗鸡IgG Fc血清。     

猪IgM的分离纯化及其抗血清的制备

经硫酸锌盐析沉淀、Sephadex G-200凝胶过滤层析,分离纯化猪血清中IgM,得到了均一性较好的IgM,用此IgM免疫家兔制备了与IgG、IgA无交叉反应的特异性较强的抗IgM血清。     

鸡血清载脂蛋白AⅠ的分离纯化及其抗血清的制备

用磷钨酸沉淀制备鸡血清HDL，乙醇-丙酮混合液(体积比为1：1)脱脂后采用DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析法分离鸡血清apoAⅠ，分离获得的apoAⅠ在尿素-SDS-PAGE电泳中呈现单一条带，其分子质量约为27788u。将提取的apoAⅠ对新西兰雄兔进行多次免疫，制备得兔抗鸡apoAⅠ抗血清，其效价为1：16。在免疫电泳和双向免疫扩散试验中抗血清均只呈现1条清晰沉淀带。试验结果表明，用磷钨酸沉淀法制备兔抗鸡apoAⅠ抗血清，过程简便，时间短且分离效果好。     

鸡Mx基因的表达及其抗血清的制备

Mx蛋白已被证明具有抗A型流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的生物活性.本研究通过PCR扩增,将Mx基因克隆至pMD18-T载体;经测序验证后将Mx基因克隆到原核表达载体pProExHTa和pcDNA3.1中.以构建的重组质粒pProExHTa-Mx转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达,以切胶纯化方式回收了Mx融合蛋白,加佐剂乳化,免疫新西兰白兔制备抗血清;SDS-PAGE和western blot分析表明:Mx基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式稳定表达,表达产物的相对分子量约80 ku,与预期值相符;抗血清能与Mx蛋白发生特异性反应.以真核表达重组质粒pcDNA3.1-Mx转染293T细胞,间接免疫荧光试验结果表明:原核表达蛋白免疫动物制备的抗血清与真核表达的Mx蛋白发生良好的免疫反应,表明用原核表达的Mx蛋白具有真核表达Mx蛋白相似的免疫学活性.抗血清的制备为鸡Mx蛋白的功能研究、Mx蛋白在转基因动物机体中表达的检测奠定了基础.     

鸡STARD3胞外域的原核表达及其抗血清制备

为获得鸡类固醇激素合成急性调节蛋白结构域3(STARD3)胞外域融合蛋白的特异性抗血清,采用人工合成方法获得鸡STARD3胞外域基因,利用pGEX6P-1质粒及BL21(DE3)进行原核表达,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,利用Western blot及间接ELISA方法测定抗体特异性和效价。结果显示:获得了STARD3胞外域融合蛋白的特异性抗血清,效价大于1∶6 400。本试验为研究鸡STARD3蛋白功能奠定了基础。     

猪抗克伦特罗(CL)抗血清的制备及其IgG纯化与鉴定

为了获得高特异性、高纯度的猪抗克伦特罗 (CL)IgG ,将克伦特罗跟牛血清白蛋白 (BSA)偶联后 ,选取 1 0头大×大×约三元杂交猪 (5头为免疫组 ,5头为对照组 ) ,用偶联物BSA CL对其进行免疫 ,来制备猪抗CL抗血清。以卵清蛋白 (OVA)跟CL的偶联物OVA CL为包被抗原 ,采用ELISA法测定抗血清效价和血清阻断率。结果表明 ,有 4头猪体内产生了抗CL抗体 ,且在第 2次加强免疫后达到最大 ,效价为 1∶2 0 0 0 0 ;而当血清稀释率为 1∶40 0 ,CL的PBS液浓度在 1 8× 1 0 - 4 ～ 7 0× 1 0 - 7之间时 ,其阻断率为 80 %～ 1 8%。随后用正辛酸 硫酸铵法对血清抗体进行纯化 ,经紫外吸收法测定和SDS PAGE电泳试验结果表明IgG成份得到了纯化 ,可用于进一步的免疫试验     

鸡白细胞介素-18基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

将编码鸡白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，目的蛋白表达量占菌体蛋白的30％。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-18融合蛋白相对分子质量约为23000。包涵体被6mol／L盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-18融合蛋白及其纯化产物经3次肌肉注射豚鼠，制备豚鼠抗鸡IL-18多克隆抗血清，并用琼脂扩散试验多克隆抗血清进行了证明。本试验成功的原核表达、纯化了鸡IL-18融合蛋白，并制备了抗鸡IL-18多克隆抗血清，为下一阶段关于鸡IL-18重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。     

鸡γ-干扰素基因原核表达及多抗血清的制备

将扩增的鸡γ-干扰素基因(CHIFN-γ)克隆至原核表达载本pET30a上,构建了重组表达质粒pET-30a-CHIFN-γ.将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃不同时间诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,且以可溶蛋白的形式存在.蛋白通过镍离子亲和树脂进行纯化,并作为免疫原制备兔抗CHIFN-γ多抗血清.Western-blotting结果表明目的蛋白与多抗血清有免疫反应性.     

人补体C1INH基因的原核表达及其抗血清的制备

 采用PCR技术获得人补体C1INH基因全长,以其为模板扩增出抗原表位基因片段命名为C1,然后将C1片段重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌;IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21培养物,纯化蛋白后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析表明,pET32a-C1融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6 400;Western-blot检测显示,抗血清可与原核表达的C1INH蛋白进行特异性结合,为进一步检测真核表达蛋白及研究rhC1INH的功能活性,并为C1INH的临床检测奠定基础。     

冰鲜鸡生产链中沙门氏菌的分离鉴定及PFGE分型研究

为揭示冰鲜鸡生产链中沙门氏菌的分布及传播机制,本研究于2013年7月～2013年12月采集广东某大型一体化养鸡企业下属2个种鸡场、2个孵化场、2个肉鸡场、1个屠宰场和5个销售点样品,用常规法和PCR进行沙门氏菌的分离鉴定,并对分离出的沙门氏菌进行血清学鉴定和PFGE分子分型.种鸡场、肉鸡场、屠宰场和销售点的沙门氏菌的检出率分别为1.46%(7/480)、7.00%(21/300)、62.86%(22/35)和54.67%(41/75),孵化场雏鸡胎粪检出率为1.11%(2/180),死胚检出率为12.00%(9/75).屠宰和销售环节是沙门氏菌污染的重要环节,食品安全风险较高.102株沙门氏菌共产生24种不同的PFGE谱型,从不同环节分离到多组相似度为100%的沙门氏菌,表明冰鲜鸡生产链中存在沙门氏菌沿生产链传播的现象.     

鸡Perilipin1抗血清制备及组织表达特性分析

通过制备鸡脂滴包被蛋白(Perilipin1)的抗血清,分析鸡Perilipin1的组织表达特性并推测其在脂肪组织脂类代谢过程中发挥的功能。利用RT-PCR的方法扩增鸡Perilipin1基因,并将其构建到含有His标签的表达载体pET-28a上。将阳性重组表达质粒pET-28a/Perilipin1导入大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下产生His/Perilipin1融合蛋白,对产生的His/Perilipin1蛋白包涵体进行复性处理,复性后以其为免疫原制备鸡Perilipin1多克隆抗血清。通过ELISA和Western blot的方法检测抗血清的效价及特异性,并利用此抗血清分析鸡Perilipin1在各种组织中的表达特性以及比较其在高、低脂系公鸡间的表达差异。ELISA和Western blot结果表明,本试验获得了效价高、特异性强的鸡Perilipin1抗血清,同时Western blot检测Perilipin1的组织表达特性结果表明,Perilipin1仅在鸡脂肪组织中表达,而在肝脏、十二指肠、胸肌、腿肌、肌胃、心脏、脾脏、肾脏等组织中未检测到表达信号;Perilipin1在肉鸡高脂系脂肪组织中的表...     

鸡精原细胞分离纯化与体外培养初探

本研究以组合酶分步消化法并利用Percoll梯度分离、贴壁纯化的方法，从不同时期的鸡睾丸组织中分离精原细胞。结果发现：①Percoll分离后，出壳6d雏鸡获得的细胞总数、精原细胞总数、精原细胞纯度分别为282．1、174．6、61．9％，其中精原细胞纯度比孵化15d、19d鸡胚和出壳后13d雏鸡分别高10．2％、5．7％和2．5％；②贴壁纯化后精原细胞纯度达到82％，比未经贴壁纯化的精原细胞纯度高出15．6％；③在无饲养层培养条件下，比较Percoll梯度分离前、后鸡精原细胞体外培养的情况，Percoll梯度分离前精原细胞贴壁在时间上比分离后较快，且分离前精原细胞体外存活时间亦比分离后长。     

大肠杆菌K88纤毛抗原的提纯和抗血清的制备

以5％绵羊血改良Minca琼脂筛选和克隆表达良好的K88^＋菌株，改良Minca琼脂培养获得K88菌液。用加热法及高速匀浆法使K88纤毛从菌体上脱下。饱和硫酸铵沉淀粗提，用Sepharose CL-4B凝胶过滤纯化K88抗原。提纯的抗原经SDS—PAGE电泳测定其分子量约为25000，且仅此一条蛋白带；与K88抗血清进行琼脂扩散试验只出现一条沉淀线。用提纯的抗原经多次免疫家兔制备了K88抗血清。抗血清在玻板凝集试验中只凝集K88菌株，不凝集K99，987P或F41菌株；在琼扩试验中，只与K88粗提抗原出现一条沉淀线，且效价为1：64，而不与K99，987P抗原出现沉淀线；在免疫电泳试验中，与无细胞K88纤毛液只出现一条沉淀线。鉴定结果表明，所制备的K88血清特异性强、效价高，可作为单因子血清用于凝集试验、琼扩试验等血清学试验，对K88菌株进行鉴定，对K88纤毛抗原进行定性和定量检测。     

鸡胚胎干细胞的分离及其嵌合体制备条件探索

分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后,进行碱性磷酸酶活性检测和SSEA-1染色鉴定;并用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs。受体种蛋经赤道面开窗后,将经转染的ESCs注射到受体鸡胚胚下腔,以便制作嵌合体鸡;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:5只存活的的嵌合体鸡血液中没有发生EGFP基因嵌合,但有4只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中有2只鸡的性腺发生嵌合,表明利用赤道面开窗后对受体鸡进行胚下腔显微注射可以生产嵌合体鸡。     

鸡BLB重组蛋白的原核表达及多抗制备

为分析鸡主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类抗原β亚基BLB蛋白在鸡脾脏中的表达情况,本研究采用RT-PCR技术从鸡脾细胞中扩增了BLB基因的保守区第3外显子的部分序列,大小约为380 bp.将其克隆于表达载体pET-30a(+)中.在大肠杆菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导表达,获得大小约为19ku以包涵体形式存在的His-BLB重组蛋白.切取含有重组蛋白的SDS-PAGE胶免疫实验兔,获得抗血清.以制备的血清通过westemblot在鸡脾脏中检测到MHCⅡ类分子特异性条带,其大小约为28 ku,与BLB天然蛋白的大小相符合.本研究为进一步分析MHC-Ⅱ类分子在鸡体内的蛋白表达水平提供了依据.