中华绒螯蟹血清凝集素的分离纯化与性质研究

运用硫酸铵盐析和GlcNAc-Sepharose 6B亲合层析等方法从中华绒螯蟹的血清中分离出一种天然的凝集素,经SDS-PAGE测得其分子量约为82 kD,由单一亚基组成,由等电聚焦凝胶电泳测得其等电点(pI)为5.4.糖凝集抑制试验中检测到葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、果糖和蔗糖对中华绒螯蟹血清凝集素均没有抑制作用,但N-乙酰氨基糖GIcNAc、GalNAc和ManNAc等能抑制其凝集活性.热变性试验结果表明,温度为10～50℃,凝集素仍保持强的凝集活性,但温度升至60℃后,凝集活性迅速下降,至80℃失去凝集活性,在pH 4.0～8.0的各缓冲液中保持较强的凝集活性,而在此pH范围外,凝集活性均有不同程度的下降.中华绒螯蟹血清凝集素可使外源红血细胞发生凝集,还具有凝集细菌或抗菌作用.     

中华绒螯蟹血清中外源凝集素的凝集作用及影响因素

中华绒螯蟹血清中的凝集素可凝集人、兔、豚鼠、小白鼠、鹌鹑、鸡、蟾蜍、鳝鱼等动物血细胞,但不凝集鲫鱼血细胞;此外,该凝集素亦可凝集双球菌、蕈状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌等细菌。该凝集素凝集活性可被L-山梨糖、D-果糖、D-半乳糖轻微抑制,并表现出对pH和温度的广泛适应性,在pH为2－12,温度为8℃－64℃范围内均具凝集活性。中华绒螯蟹血清中的凝集素对上述几种动物血细胞的凝集效价高于罗氏沼虾和克螯虾。     

军山湖中华绒螯蟹血清凝集素特性分析

从军山湖中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)获得血清,用人A、B、AB、O型红细胞、鸡红细胞及部分细菌菌体检测了血清的凝集活力,同时进行了糖抑制、热稳定性及pH影响试验。结果显示血清能凝集人四种血型红细胞和鸡红细胞,其中对人A型红细胞凝集活力最高;能够和大肠杆菌发生凝集反应,但不能和枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌发生凝集反应;凝集条件为pH5.0~5.8、温度4~37℃;1.0%的D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖均能不同程度地抑制血清与人A型红细胞的凝集作用。     

尿素对中华绒螯蟹幼蟹非特异性免疫功能的影响

分别用0.24、0.48、0.72、0.96、1.20g/L的尿素溶液饲养中华绒螯蟹幼蟹7d,测定幼蟹血清中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽-S转移酶(Glutathione-S transferase,GST)的活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量.结果表明,随着时间的延长,各浓度组中华绒螯蟹幼蟹血清中上述3种酶的活性逐渐下降,丙二醛含量逐渐上升;随着浓度的增加,3种酶活性有逐渐下降的趋势,但0.24g/L尿素浓度组中华绒螯蟹幼蟹血清中超氧化物歧化酶活性和0.96g/L浓度组中华绒螯蟹幼蟹血清中谷胱甘肽-S转移酶活性显著高于其他处理组,这两组中华绒螯蟹血清中丙二醛含量则相应下降.表明尿素浓度增加使得中华绒螯蟹幼蟹体内清除脂质过氧化物、过氧化氢和自由基的能力下降,对中华绒螯蟹幼蟹体内的非特异性防御系统有损伤.     

用鼠红细胞膜纯化中华绒螯蟹血清凝集素的方法

本研究建立鼠红细胞膜吸附法纯化中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血清凝集素的方法,并与硫酸铵盐析、凝胶过滤层析和离子交换层析等其他提取方法进行比较。实验结果表明,中华绒螯蟹血清经鼠红细胞膜吸附后,再由EDTA把结合的凝集素从膜上解离,可以获得纯化的高活性凝集素。该纯化物在PAGE中出现2个清晰的区带,一个是大分子的b带,另一个则是由3种大小相近的小分子组成的c区带;在SDS-PAGE中,则显示出3个分子量接近、约为100 000的条带。经50％饱和硫酸铵盐析或用Sephadex G200凝胶过滤层析法可浓缩但不能纯化中华绒螯蟹血清凝集素。经DEAE-Sephadex A50离子交换层析法可获得2个蛋白峰,其中只有1个峰有凝集活性,在PAGE中表现为a蛋白带。凝集活性较高、分子量较大的蛋白带。上述实验结果表明,应用鼠红细胞膜法可纯化中华绒螯蟹血清凝集素。     

中华绒螯蟹血淋巴抗凝剂的筛选

选用草酸钾等 10种抗凝剂对中华绒螯蟹血淋巴进行抗凝试验，结果表明，1．67倍抗凝剂 8(0．23 mol/LNaCl、0．17mol/L葡萄糖、50．00mmol/L柠檬酸三钠、43．33mmol/L柠檬酸、16．67mmol/LEDTA- Na₂，pH5．5)为中华绒螯蟹血淋巴一种比较理想的抗凝剂，当抗凝剂与血淋巴体积比为 2∶5时，这种抗凝剂不仅能有效延长中华绒螯蟹血淋巴的凝固时间达69．8min以上，而且还能较好地维持中华绒螯蟹血细胞形态的完整性。     

日本沼虾血清凝集素特性研究

取日本沼虾血淋巴液,利用血凝实验和糖抑制实验测定其血清凝集素的凝血活性和糖专一性,对血清凝集素热稳定性、pH值、盐度、重金属离子、EDTA-Na2、有机磷农药、黄酮和多糖类物质对其活性的影响进行了探讨。结果显示:日本沼虾血清凝集素可以对兔、鸡、小鼠、蟾蜍和鲢鱼5种动物血红细胞产生凝集反应,以对小鼠和鸡血红细胞的凝集效价较高。能够专一性结合D-葡萄糖,D-果糖而产生抑制效果。在50~60℃范围内凝集活性最强,80℃及以上凝集素发生变性,无凝集活性。该凝集素pH值作用范围广泛,在pH值2～12都可以使鸡红细胞发生凝集,pH值3～7范围内凝集效果较好。盐度为13～15时,凝集活性最强。凝集素活性能被浓度高于16mmol/L(含16mmol/L)的EDTA-Na2完全抑制,对重金属离子Cu2+和Zn2+敏感性强,其活性被完全抑制。乙酰甲胺磷和敌百虫对日本沼虾血清凝集素活性有一定的影响,黄酮和多糖类物质可显著增强虾血清凝集素的凝集作用。     

锯缘青蟹血清凝集素的特性和盐析提取研究

对锯缘青蟹(Scylla serrate)血清凝集素的凝集特性进行了研究。结果显示:锯缘青蟹血清凝集素对人、兔、鼠、鸽子、中华鳖、鲫红细胞均有凝集作用,其中对小鼠红细胞凝集活性最强,血凝活性可达29;凝集素活性最适pH 6.0~7.4;盐度对凝集活力有较大影响,NaC l浓度在0.4~0.5 mol/L时基本失活;未纯化血清凝集素对Ca2+、Mg2+未表现出依赖性;凝集素活性能被N-乙酰葡萄糖胺特异性抑制。对青蟹血清凝集素进行硫酸铵分级沉淀分离后,发现凝集素活性主要分布在25%饱和度硫酸铵沉淀区,该组分凝集比活比血清高27.44倍,SDS-PAGE结果表明主要蛋白带型为79 ku、75 ku、72 ku。     

枯草芽孢杆菌基因组DNA对中华绒螯蟹非特异性免疫因子的影响

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtzlis)基因组DNA按5、20和80μg/kg剂量体腔注射中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)(约0.1 mL/只),设注射等体积TE缓冲液为对照组,分别在第1、3、5、7天采样,测定该细菌DNA对中华绒螯蟹的免疫刺激作用。结果显示:注射上述3种剂量的枯草芽孢杆菌基因组DNA均能不同程度地提高中华绒螯蟹的THC、血细胞呼吸爆发活性和血清PO、ACP活性,试验组蟹的上述免疫指标的活性显著高于对照组(P<0.05),并以20μg/kg体重剂量的刺激效果最好;但试验剂量的细菌DNA对血清ALP活性无显著影响(P>0.05)。     

中华绒螯蟹血细胞体外吞噬能力的研究

通过体外制备血细胞单层的方法,研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血细胞对蜡状芽孢杆菌(Bacil-luscereus)及鼠红细胞的吞噬能力,并探讨了血清孵育对血细胞吞噬能力的影响。结果表明,以vanHARREV-ALD氏液配制的浓度为100.0mg·mL-1的L-cysteine溶液可以作为中华绒螯蟹血淋巴的抗凝剂,中华绒螯蟹血细胞在20℃下培养1h的存活率可维持在(92.5±0.9)%。中华绒螯蟹血细胞贴壁后呈扁平状,胞质可沿玻片表面迅速伸展并伸出类似于伪足的原生质突起,具有吞噬能力,对蜡状芽胞杆菌吞噬率为(5.1±1.4)%,不能吞噬鼠红细胞,血清孵育不能增强中华绒螯蟹血细胞的吞噬能力。     

凝集素的作用与应用

凝集素是一类具有糖专一性、可使细胞凝集的糖蛋白。它能与糖专一性、非共价可逆结合,广泛存在于植物、动物等生物细胞膜上、细胞质内和细胞外基质中。由于凝集素的存在比较广泛,且具有专一性的识别能力,具有促使细胞凝集、细胞有丝分裂、防御昆虫危害、消除入侵的微生物等外源     

日本对虾血清凝集素及其免疫作用的初步研究

用日本对虾（Penaeus japonicus)亲虾的血清与11株弧菌和7种脊椎动物的红细胞进行凝集反应实验，其中，溶藻弧菌HW283的凝集效价最高，达4096，而产气弧菌和海蛹弧菌的凝集效价最低，仅为8；与红细胞的凝集结果显示，对虾血清与大白鼠，小白鼠，豚鼠的红细胞反应较强，与鸡、人、山羊、兔的红细胞反应较弱，表明日本对虾血清中存在自然凝集素，养成期的日本对虾经弧菌菌苗免疫后，对该致病菌株的抵抗力获得提高，病原感染组，对照组和菌苗免疫组的对虾血清分析对豚鼠，大白鼠和小白鼠红细胞的凝集强度皆为感染组＞对照组＞免疫组。     

3种海洋贝类凝集素的初步研究

通过用7种红细胞对3种海洋贝类褶牡蛎（Crassostrea plicatula）、缢蛏（Sinonova culaconstricta）和紫贻贝（Mytilus edulis）的凝集素进行凝血活性检测。结果表明：3种贝类凝集素对7种红细胞都有凝集活性,其中紫贻贝的凝集活性最高,家兔红细胞较为敏感。3种贝类凝集素对兔血细胞的凝集活性都可被10种糖不同程度地抑制,亦可被EDTA抑制。3种贝类凝集素在pH=4、pH=5的条件下仍然对兔血细胞显示出较高的凝集活性。缢蛏和紫贻贝的凝集素在80、90℃下处理10分钟,对兔血细胞反而表现出更高的凝集活性,而褶牡蛎的凝集素则在40℃时即丧失活性。     

中国对虾血淋巴液中的凝集素

用饱和硫酸铵盐析、Ｓ－２００－ＨＲ凝胶层析、ＤＥＡＥ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析从中国对虾（ｆＰｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）血淋巴液中分离出１种凝集素,通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,该凝集素由２个亚基组成,分子量分别为８００００、７５０００;此凝集素能凝集牛、马、鼠、兔、鸡、羊和人Ａ、Ｂ、Ｏ型红细胞,其凝集活性不被Ｄ－甘露糖、Ｄ－果糖、Ｄ－乳糖、乙酰半乳糖、神经氨酸、Ｄ－葡萄糖、Ｄ－半乳糖和     

中华倒刺鲃血清凝集素的研究

从中华倒刺鱼巴(Spinibarbus sinensis)血清分离到一种天然的凝集素,能够凝集多种不同的抗原物质,其组成成分为糖蛋白,具有耐热和耐酸碱性,对β-巯基乙醇敏感。凝集反应受温度、PBS离子浓度以及时间等因素的影响。经糖的专一性抑制实验显示,蔗糖和乳糖对凝集反应有抑制作用,说明这2种糖分子是凝集素在识别和凝集过程中起一定作用的糖分子。     

南美白对虾血清凝集素的凝集活性及部分性质研究

利用血凝试验及糖抑制试验测定南美白对虾的血清的凝血活性及糖抑制专一性,同时进行热稳定性、pH及Ca2 影响试验。结果显示:南美白对虾血清只能凝集4种红细胞、4种单细胞藻类、4种微生物细胞或孢子。血清对家兔红细胞的凝集可被乳糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖和D-葡萄糖5种糖所抑制,其凝集活性均依赖于Ca2 ,在pH为4 0～8 0范围内较稳定,经50℃保温10min后活性完全消失。     

南方鲇血清凝集素的研究

从南方鲇(Silurusmeridionalis)血清分离到一种天然的凝集素分子,能够凝集多种不同的抗原物质,其组成成分为糖蛋白,具有耐热和耐酸碱性,对β-巯基乙醇敏感。凝集反应受温度、离子强度以及时间等因素的影响。经糖的专一性抑制实验显示,蔗糖和半乳糖对凝集反应有抑制作用,说明这2种糖分子是凝集素在识别和凝集过程中起一定作用的糖分子。     

中国对虾血淋巴凝集素的血凝活性与促噬活性

1999年8月，运用血凝活性测定法分别检测中国对虾血淋巴弹簧集素，血淋巴液、血细胞、肌肉、肠、肝胰腺和甲壳的血凝活力，并运用吖啶橙血细胞吞噬测定法检测血细胞的吞噬活力，同时测定了经注射中国对虾副粘病毒提纯液后血淋巴凝集素血凝活力及血淋巴液抗菌活力、酚氧化酶活力、溶菌活力，结果表明，血淋巴凝集素主要分布在血淋巴液和血细胞中；该凝集素对人（A、B、O型），鸡和兔红细胞及其醛化红细胞的凝集具有一定专一性；对血细胞吞噬异物具有促进功能；注射副粘病毒提纯液后，血淋巴凝集素凝集活力变化和血淋巴液抗菌活力，酚氧化酶活力、溶菌活力变化相一致。     

日本对虾血清凝集素的基本物理化学性质

日本对虾（Penaeus japonicus)亲虾体长19-24.5cm，取其血清。7种动物血液取自大白鼠、小白鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、人。结果表明：（1）虾血清分别在28、37、56℃时热处理30min，其凝集活性不变，在70℃和80℃热处理30min后凝集活性完全丧失。（2）血清在pH和5-7.5的TBS缓冲液中凝集活性稳定，在pH为8-9之间凝集活性迅速下降。（3）凝集抑制实验表明半乳糖、甘露糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺等5种糖对血清凝集素都有较强的抑制作用，尤其D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺的抑制作用更强。（4）交叉吸附实验结果显示日本对虾血清对大白鼠、小白鼠的红细胞有较强的亲和性。