脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建

携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID₅₀)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP...     

用植物病毒载体表达小球状病毒抗原蛋白的研究

将引起人类腹泻主要病原物小球状病毒(Small round structured virus;SRSV)编码抗原蛋白基因的全长序列1605bp,导入来自三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus;ClYVV)侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pClYVV/CP/W基因组的NIb/CP基因之间,构建了重组病毒克隆pClYVV-NV1.6。用上述重组病毒克隆接种蚕豆植物,表现了与野生型ClYVV相同的症状。从发病叶中提取总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)对上述重组病毒克隆的转录进行了检测,结果表明,外源基因在F4子代病毒基因组中仍然稳定存在。从发病叶中提取总蛋白,用酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)及蛋白质杂交(Western blotting;WB)对上述重组病毒克隆表达的目的基因产物抗原蛋白进行了测定,结果表明,重组病毒克隆pClYVV-NV1.6之目的基因产物的表达量随寄主植物发病后时间的推移而变化,最大表达是在寄主植物发病后第9天,最大表达量为每克鲜叶可表达160.00μg,这一研究结果为用植物生产抗SRSV口服疫苗提供了有力的基础。     

山西舍饲羊群羊痘病毒的分离和实验室诊断

为了分离舍饲羊群羊痘病毒并对其进行诊断研究,对山西舍饲羊群疑似羊痘发病羊的口唇痘状痴皮组织提取物进行细胞培养以扩增病毒,对病变细胞用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察,然后进行动物回归实验和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).结果表明:扩增的病毒经连续培养3代后出现规律性细胞病变;用常规HE染色可见细胞中出现由于病毒感染产生的包涵体;动物回归实验表明已分离的病毒可导致动物发生痘性病变:用ELISA 检测出现显色反应,表明样品中存在与酶标抗体发生反应的病毒抗原,样品病毒浓度为6.835 IU·L-1.实验成功诊断并分离出山西舍饲羊群羊痘,为后续研究提供了理论基础.     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备

采用RT-PCR技术从感染马铃薯X病毒贵州分离物PVX-GZ的普通烟叶片中扩增出该病毒的外壳蛋白基因CP。测序结果表明,该CP基因全长714 bp,编码237个氨基酸残基。构建原核表达载体p ET32a(+)-CP,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在25℃条件下以0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthivgalactopyranoside,简称IPTG)诱导表达重组蛋白基因;SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为45 ku;以该重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备的抗体效价达1∶12 800;间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunsorbent assay,简称ELISA)检测显示,该多抗能与PVX病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他5种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。结果为病毒血清学检测试剂盒的研发奠定了基础。     

贵州矮马和西南马3种病毒性疫病的血清学分析

为探明2012—2013年贵州省紫云县马匹大量死亡的病因,为其科学防治提供参考,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法对当地养殖的贵州矮马、西南马进行马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia virus,EIAV)、马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)和马疱疹病毒I型(Equine herpesvirus type-1,EHV-1)3种病毒的抗体水平检测,并与伊犁马进行比较。结果表明:3个马群中均未检测到EIAV抗体,EHV-1抗体阳性率达98.15%~100%;与伊犁马相比,贵州矮马和西南马EAV抗体的阳性率较高,分别为48.15%和19.35%,并与2个马群的血液理化指标存在一定相关性。紫云县贵州矮马和西南马存在较高比例的EAV感染,马驹和虚弱马匹感染EAV后死亡率较高,因此推测EAV可能是导致马匹死亡的原因之一。     

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为探明2012-2013年贵州省紫云县马匹大量死亡的病因,为其科学防治提供参考,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法对当地养殖的贵州矮马、西南马进行马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia virus,EIAV)、马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)和马疱疹病毒Ⅰ型(Equine herpesvirus type-1,EHV-1)3种病毒的抗体水平检测,并与伊犁马进行比较.结果表明:3个马群中均未检测到EIAV抗体,EHV-1抗体阳性率达98.15％～100％;与伊犁马相比,贵州矮马和西南马EAV抗体的阳性率较高,分别为48.15％和19.35％,并与2个马群的血液理化指标存在一定相关性.紫云县贵州矮马和西南马存在较高比例的EAV感染,马驹和虚弱马匹感染EAV后死亡率较高,因此推测EAV可能是导致马匹死亡的原因之一.     

陕西省烟草主要病毒病种类及植物带毒的检测

【目的】明确陕西省烟区烟草主要病毒病种类及烟田周围携带病毒植物的种类及带毒情况。【方法】采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),对从安康、宝鸡、商洛、延安、咸阳、汉中和铜川烟区采集感染病毒病的167个烟草样品以及烟田周边7科23种植物的279个植物样品进行了检测。【结果】从感染病毒烟草样品中检测到烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)5种病毒。其中CMV的侵染最普遍,总检出率达74.34%;PVY、TMV、TEV、TVBMV的总检出率分别为58.16%,47.29%,21.59%和18.87%。在156个烟草阳性样品中,有28个样品受CMV、TMV、PVY或TVBMV单独侵染,其检出率分别为4.78%,10.09%,1.66%和1.18%,未检测出TEV单独侵染;其余样品均受2种以上病毒复合侵染,总检出率为82.05%。烟田周边279个植物样品中,176个植物样品被检测出携带有包括TMV、CMV和PVY等在内的烟草病毒,病毒检出率占63.08%。毒源植物样品中病毒检出率最高的植物为刺儿菜,其病毒检出率高达92.86%,其次为番茄、茄子、辣椒、蚕豆,其病毒检出率分别为90.91%,87.50%,86.67和78.57%。【结论】CMV取代TMV和TEV已成为当前陕西烟区的优势毒种,PVY检出率在部分烟区有明显上升的趋势。田间烟草病毒复合侵染现象严重,值得高度重视。烟田周围植物是烟草病毒病防治的重要考虑因素。     

本氏烟组蛋白H4与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染

以番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus, ToMMV)外壳蛋白(Coat protein, CP)为研究对象,通过荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay, LCI)研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示,ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中,组蛋白H4定位于细胞核中,两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明,烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术沉默本氏烟烟草中的H4基因,对沉默H4基因的植株接种ToMMV,接种后第4 d,通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量,发现病毒含量显著低于对照组,结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制,组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细...     

鹅α干扰素基因在COS-7细胞中的瞬时表达及抗病毒功能初探

为了研究鹅α干扰素( goIFN-α)基因的特性和功能,将天府肉鹅的α干扰素基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上,构建重组质粒pcDNA3.1-goIFN-α,脂质体介导将其转入COS-7细胞中;应用间接免疫荧光、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫印迹(Western-blot)法检测goIFN-α基因在COS-7细胞中的转录和表达情况,并对COS-7细胞表达上清液进行抗病毒活性检测.结果表明:目的蛋白在转染12 h后就可以被检测出,36 h前目的蛋白在上清液中快速增加,之后增加速度变慢;重组质粒能够在COS-7细胞内得到高效表达,表达的蛋白分子质量为38ku,比预测的分子质量(约21 ku)大;间接免疫荧光显示,细胞内出现黄绿色荧光,胞核附近最亮;表达产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒(VSV)及小鹅瘟病毒(GPV)的活性.     

计算机病毒的预防和杀毒策略

针时计算机病毒的种类,常见的传播方式,命名规则以及命名解释进行了介绍,并根据其传播方式,介绍了相应的防毒措施和有效的顽固性病毒杀毒策略。按照所介绍的知识,能够防止绝大部分病毒时网络计算机的入侵,并能够在杀毒软件无效的情况下,对顽固性病毒进行彻底地查杀。     

种籽和花粉传播植物病毒状况及存在问题

本文综述了国内外有关种籽和花粉传播植物病毒的重要资料,指出种籽传播病毒的特征．目前已知的在分类上属于２３群的１０８种和未归类的９种种传植物病毒中,我国已见报道的有１７种,花粉传播的植物病毒共１０种,其中９种分属于３个分类群,另有１种尚未归类．对存在的问题提出了讨论．这些问题包括多种过去被误认为是种传的病毒、同物异名的种传病毒、隐性病毒、未经证实的种传病专以及通过花粉和种籽传播的“类病毒草”等．     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK-/gI-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoRⅤ/StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRⅤ。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRⅤ,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

目的 建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。方法 选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。结果 三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10 μL^-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。结论 本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。     

植物病毒检测技术研究进展

综述了植物病毒鉴定与检测技术的研究进展,介绍了生物学、电子显微镜观察、免疫学、分子生物学技术（PCR、NASH、FISH、ds-RNA、芯片检测等）方面的植物病毒检测方法的特点、发展应用方向等。     

鸡痘病毒载体研究进展

本文就鸡痘病毒作为基因工程重组疫苗的重要载体研究的进展作以综述，主要包括鸡痘病毒表达载体的构建，外源基因在重组鸡痘病毒中的表达及免疫效果，并对鸡痘病毒载体的研究及开发应用前景加以展望。     

陕西辣椒病毒病的毒原鉴定及化学防治药剂筛选

分别从陕西咸阳、兴平、杨凌、柔谷、眉县、岐山、凤翔等地采集辣椒病毒病标样126份,在室内通过单斑分离及回接验证得到5种分离物,采用鉴别寄主的生物学反应和DA S-EL ISA法鉴定,结果表明,引起陕西辣椒病毒病的毒原有黄瓜花叶病毒(CM V)、烟草花叶病毒(TM V)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和蚕豆萎蔫病毒(BBW V),其中CM V和TM V是优势毒原种群,分别占检测样品的60.31%和30.94%。在室内分别以CM V和TM V的枯斑寄主苋色藜和心叶烟为测试寄主,采用半叶法对接种叶片分别于接种前和接种后涂施病毒抑制剂,测试了7种病毒抑制剂的抑制效果。结果表明,接种前后涂施3.85%病毒必克水乳剂500倍液,均对黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒有很好的防治效果,且接种前涂施的防治效果较接种后涂施的防治效果好。     

广州市郊及其邻近地区辣椒CMV和TMV的鉴定

根据对广州市郊及其邻近地区辣椒病毒病的田间调查、寄主范围和症状特点、血清学反应以及RT-PCR的试验结果，证实了黄瓜花叶病毒(CMV)是广州市郊及其邻近地区辣椒病毒病的主要毒原之一；通过生物学和血清学方法，鉴定了烟草花叶病毒(TMV)是另一主要毒原。在采集的病样中，根据鉴别在寄主上的症状特点，主要存在两种类型的分离物，分别称为分离物Ⅰ和分离物Ⅱ。分离物Ⅰ在辣椒、西葫芦、三生烟、普通烟、心叶烟、曼陀罗等寄主植物上引起花叶等症状，在苋色藜、昆诺阿藜上产生局部枯斑，不侵染千日红，由此可初步鉴定为CMV；从间接ELISA和RT—PCR的检测结果也可判断分离物Ⅰ是CMV，其检出率为36．67％。分离物Ⅱ在辣椒、普通烟上产生花叶症状，在心叶烟、曼陀罗、千日红、三生烟、苋色藜和昆诺阿藜等寄主植物上产生局部枯斑，而不侵染西葫芦，由此可初步鉴定其为TMV；间接ELISA检测结果表明，分离物Ⅱ是TMV，其检出率为43．33％。另外，TMV在田间发生率明显高于CMV。     

小苍兰3种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus (FreMV)、黄瓜花叶病毒Cucumubermosaic virus (CMV)和菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus (BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测小苍兰3种病毒的多重PCR检测体系.该体系能够一次扩增出FreMV,CMV和BYMV的特异片段,其大小分别是340、628和212 bp.测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达97％以上.灵敏度测定结果表明,从≥10-2mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒.     

甘蔗杂交种子传播甘蔗花叶病毒、高粱花叶病及黄叶病的检测

[目的]探究甘蔗杂交种子对甘蔗花叶病毒、高粱花叶病及黄叶病的传播性,为甘蔗抗病育种提供参考.[方法]采集父本或母本感染花叶病或黄叶病的甘蔗杂交种子样品10份,分别以SCMV、SrMV和SCYLV特异性引物进行一步法RT-PCR扩增、克隆和测序分析.对田间实生苗进行生物学观察,并采用RT-PCR检测其叶片SCMV、SrMV和SCYLV携带性.[结果]经特异性引物检测,10份杂交种子中仅有样品H4显示SrMV阳性,扩增的特异片段大小为828 bp,其核苷酸序列与GenBank中已报道的SrMV基因序列同源性达99％.聚类分析结果表明,样品H4的SrMV和GenBank中SrMV外壳蛋白序列的自举水平达100％,证实H4样本感染的病毒为SrMV.田间连续45 d观察均未发现出现病毒症的甘蔗幼苗;经RT-PCR检测,均未在10个样品实生苗叶片中发现此3种病毒.[结论]甘蔗种子可携带高粱花叶病(SrMV),但未能通过种子传播至实生苗.