葡萄叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

现对葡萄叶片中总蛋白质的双向电泳技术体系进行了初步探讨,比较了不同等电聚集程序、不同pH胶条以及不同SDS-PAGE凝胶浓度的双向电泳效果。结果表明:葡萄叶片蛋白质使用等电聚焦程序B、pH范围为4~7的胶条和12%的SDS-PAGE凝胶可以得到较为理想的双向电泳分析结果;采用7 cm胶条最大可以分离出143个有效蛋白质点。     

甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系的建立

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。为建立适合甘蓝柱头总蛋白质的双向电泳体系,本试验以甘蓝柱头为材料,采用改良TCA/丙酮沉淀法提取柱头总蛋白质,通过对IPG胶条、上样量、聚焦程序、SDS-PAGE胶浓度等的优化,建立了甘蓝柱头总蛋白质双向电泳体系,即选用长17 cm、pH 3～10 NL的IPG胶条,上样量150 μg,按照聚焦程序Ⅰ进行等电聚焦,第二向SDS-PAGE胶浓度选用12%,得到了分辨率高、重复性好的双向电泳图片。     

山葡萄掐花序尖和疏果粒对增产效果的研究

以酿酒葡萄新品种“北冰红”及新品系“94-7-75”、“98-8-165”、“2001-6-135”为试材,研究了山葡萄品种(品系)掐花序尖及疏果粒对果实质量和产量的影响.结果表明:“北冰红”、“2001-6-135”、“98-8-165”和“94-7-75”掐除花序尖2/5和疏果粒,比对照平均减产12.0％.掐除花序尖1/5和疏果粒情况下,坐果率、果粒均重、果穗均重和果实含糖量与对照相比,平均提高6.7％、4.6％、7.6％和1.8％,比对照平均增产12.0％;其中:“98-8-165”和“94-7-75”分别比对照增产8.5％和9.0％,“北冰红”、“2001-6-135”增产幅度较大,分别比对照增产15.2％和16.9％,增产效果显著.     

酸柚硼毒害蛋白质双向电泳技术体系的优化

以硼毒害下酸柚实生苗的根和叶为试验材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、蛋白上样量、凝胶染色方法等条件进行了优化,建立了适用于柑橘蛋白质组研究的双向电泳技术体系。结果表明,使用改良后的酚抽法提取柑橘总蛋白效果较好,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数较多;当采用pH 4～7 IPG胶条、上样量为1.5 mg时,蛋白点分布广,点数最多;使用胶体考马斯亮蓝染色法,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。该体系为开展柑橘硼胁迫的蛋白质组学研究提供了技术基础。     

葡萄着色期果皮蛋白质组分析

为了研究葡萄不同着色期果皮中蛋白质表达特征,以着色初期、中期和后期等3个着色时期的葡萄果皮为研究对象,运用2-DE、MALDI-TOF/TOF-MS质谱技术以及生物信息学方法对差异蛋白进行分析,结果表明:(1)双向凝胶电泳显示,果皮着色3个时期有1050个高度重复的蛋白点,差异显著的蛋白点有162个,其中108个蛋白得到鉴定,有87个蛋白映射到葡萄蛋白质组数据库中;3个时期均表达的差异蛋白有20个,且随着果皮颜色加深,差异蛋白数量呈上升趋势。(2)GO分析显示,ATP合成酶β亚基(ATPβ)极显著富集于磷酸核糖代谢过程,对着色初期果皮生理代谢的能量需求具有重要意义。(3)KEGG分析表明,碳代谢、生物固碳、磷酸戊糖、氨基酸生物合成等代谢通路在果皮着色的不同时期显著富集。(4)qRT-PCR分析显示,S–腺苷甲硫氨酸合成酶基因(VvMETK4)在果皮着色后期表达量最高。     

人工栽培山葡萄施肥技术

从山葡萄生长发育所需的各种营养元素、基肥的种类和配比、基肥的施用量、基肥施用时期和方法、追肥的作用及其与山葡萄生长动态的关系、追肥时期以及追肥方法等方面阐述了人工栽培山葡萄施肥技术。     

葡萄种子蛋白质双向电泳体系的建立

为了进行葡萄种子蛋白质组学的研究,以葡萄种子为试材,通过对比粗蛋白质不同溶解方法、IPG胶条、上样量、等电聚焦参数以及不同SDS-PAGE分离胶浓度对双向电泳效果的影响,建立了适合葡萄种子的双向电泳体系。结果表明:TCA-丙酮提取蛋白质经酚抽提后蛋白质溶解快、杂质少、浓度高,筛选获得17cm pH 5~8的IPG胶条,上样量600μg,第一向的聚焦步骤达到80 000Vh以及11%的SDS-PAGE分离胶的双向电泳参数,蛋白质分离效果好。所建立的双向电泳体系,适用于不同葡萄品种的种子蛋白质分离。     

番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立

通过对IPG胶条梯度、上样方式、上样量、聚焦条件等4方面条件的优化,建立了番茄子叶总蛋白双向电泳体系,即采用TCA丙酮沉淀法提取番茄子叶总蛋白,选用24 cm pH3-7NL的IPG胶条,采用水化上样,上样量300 μg,按聚焦程序Ⅰ或Ⅱ聚焦后进行双向电泳分离和银染染色。若采用制备胶,以获取高含量蛋白点,则将上样量提高至1.5 mg,按聚焦程序Ⅲ进行聚焦后进行双向分离,并采用胶体考马斯亮蓝染色。采用该优化的体系可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

新红星苹果花芽蛋白质提取及双向电泳的改良方法

以新红星苹果花芽为材料,探索适合蛋白质的提取方法及其双向电泳的条件。采用物理和化学2种方法充分裂解植物组织细胞,并用低温操作加入PVP等去除植物大量的酚类物质,最后离心去除不溶性杂质的苹果蛋白质组双向电泳(2-DE)样品制备方法,第1向为ISO-DALT等电聚焦,第2向为垂直平板SDS-PAGE。通过对样品制备、双向电泳参数的选择及染色等方面进行优化,电泳图谱可分辨出蛋白质斑点数在519个以上,蛋白质相对分子质量约为14.0～97.0ku,主要分布为14.0～67.0ku;等电点约为3.5～9.0,主要分布在4.0～7.0。     

山葡萄天然红色素最佳提取条件的研究

对山葡萄天然红色素的最佳提取工艺条件进行了初步研究.通过试验确定红色素最佳提取条件为:提取剂(乙醇)浓度为70%,提取温度为70℃,提取时间70min,所得山葡萄天然红色素色价33.36U/mL.     

不同分组取样方法初步构建山葡萄核心种质的研究

根据SSR分析结果的聚类情况,采用3种方法构建124份山葡萄种质资源的核心种质,通过比较基因型数、等位基因、有效等位基因、Shannon多样性指数和基因多样度,证明采用逐步聚类法构建的核心种质代表性较好。在此基础上,考虑到雄花山葡萄的特异性和山葡萄品种在实际生产、科学研究上的重要性,人为补充了未入选的雄花山葡萄和山葡萄品种(共10份资源)。利用该法构建了由41份材料组成的山葡萄资源核心种质(取样比例占总样本的33.1%),其中野生种质资源33份,占核心种质的80.5%;选育品种8份,占核心种质的19.5%;从花型来看,雌花资源27份,占核心种质的65.8%,两性花和雄花资源各7份,各占核心种质的17.1%。山葡萄核心种质的基因型数、等位基因、有效等位基因、Shannon多样性指数和基因多样度的保留率分别为86.7%、97.9%、100.0%、99.0%和99.8%,表明构建的41个山葡萄样本的核心种质能在遗传多样性上很好地代表初始种质。     

完全花山葡萄四倍体种质的发现及鉴定

 山葡萄种质2413为75—2-200(通化3号×双庆)植株的一个枝蔓变异的自然授粉后代。对2413及75-2-200进行了形态学、组织学、孢粉学、细胞学鉴定。结果表明,2413叶片大而厚,叶柄和枝条粗壮,节间长,气孔大,花粉粒大,花粉发芽率低,体细胞染色体2n：76,证明其为四倍体。     

桃叶片总蛋白双向电泳技术的研究

采用改进的O'Farrell双向电泳系统,研究适于桃树叶片蛋白质组分析的双向电泳方法。通过对不同蛋白样品提取方法、不同pH梯度范围、不同上样量的比较,探索出一套适合桃树叶片总蛋白分析的双向电泳方法,即以TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白质样品,采用两性电解质配比pH3～10︰pH5～7为1∶4的IEF胶条,按90μg蛋白上样量,并结合适宜的双向电泳参数,可获得背景清晰、重复性较好、蛋白分辨率高的双向电泳图谱。经此方法分离的桃叶片蛋白质经串联质谱分析(MS/MS)得到了较好的鉴定。     

山葡萄的花型遗传

对１５个杂交组合１１３８株山葡萄种内杂交后代的花型进行了调查，结果表明：山葡萄花型的遗传符合Ｌｅｖａｄｏｕｘ（１９４６）的假说〔１〕，受Ｍ．Ｈ．Ｆ３个等位基因控制。野生状态下，雄花植株基因型为异质ＭＦ；目前发现唯一的两性花种质资源‘双庆’基因型为异质ＨＦ；雌能花植株基因型为ＦＦ；人工杂交以后可以产生基因型为ＨＨ的两性花植株和基因型为ＭＨ的雄花植株。     

山葡萄种质资源SSR遗传多样性分析

对360份山葡萄种质资源进行了遗传多样性分析研究。从245对引物中筛选出18对用于供试材料的SSR扩增;单条引物扩增条带为4~13条,平均9.44条;扩增产物长度介于150~1 000 bp,以200~750 bp的扩增片段居多;18对引物共扩增出170条带,其中多态性条带167条,多态性百分率为98.2%;Shannon’s多样性指数(I)为1.778051。某些品种(系)产生了特有SSR标记带,共5条,占2.95%。     

山葡萄生长过程中不同组织部位白藜芦醇含量的变化

以"左山一"山葡萄为试材,应用HPLC技术,研究山葡萄叶、茎、卷须、果实生长过程中白藜芦醇含量的变化规律。结果表明:不同组织部位的白藜芦醇含量在整个发育过程中都呈现先增长后下降的变化趋势,白藜芦醇含量由高到低的顺序为叶、卷须>茎>种子>果皮果肉。叶中白藜芦醇含量最高,达20.12μg/g。     

山葡萄性别相关AFLP分子标记的筛选及SCAR标记的转化

 山葡萄是一种重要的抗寒、抗病葡萄种质资源。通过AFLP分子标记方法,应用64对引物组合EcoR I-NNN/Mse I-NNN对山葡萄雌花、雄花和完全花植株基因池进行筛选,引物E-AGC/M-CTG在雄花和完全花植株基因池DNA中扩增出一条分子量为283 bp的特异性条带;经组池个体和其它品系验证,该特异性条带能在雄株和完全植株中稳定出现。将该特异性条带回收、克隆、测序,设计SCAR标记引物,对已知性别的85份山葡萄种质进行盲测,准确率达到97.6％,表明标记转化成功。由于该SCAR标记在绝大多数山葡萄栽培品种和有育种价值的种质资源中得到验证,可利用该SCAR标记对山葡萄杂交后代在苗期进行性别鉴定,提高育种效率。     

山葡萄应答霜霉病侵染过程中叶绿素荧光成像的变化

以抗霜霉病的‘左山一’和易感病的‘双丰’山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）为试材,离体叶片接种霜霉病菌后观察叶绿素荧光成像及参数变化。结果显示：叶绿素荧光成像系统可在接种霜霉病菌3 d时观察到病斑;霜霉病侵染叶片组织会显著改变叶绿素荧光参数;接种7 d时病斑与不接种对照相比,抗病品种‘左山一’Fv/Fm、ФPSⅡ、Y（NPQ）与Y（NO）的变化幅度（–73.42%、–100%、–49.64%、+ 3285.21%）均大于易感病品种‘双丰’的变化幅度（–22.98%、–28.17%、+ 5.62%、+ 26.18%）,‘左山一’病斑周围组织的ФPSⅡ与rETR高于对照,而‘双丰’低于对照。由此可见,‘左山一’能够较早形成枯斑,快速改变病斑处的荧光参数,并提高病斑周围组织的ФPSⅡ与rETR值,从而增强对霜霉病的抗病性。因此,病斑周围组织的ФPSⅡ与rETR可以作为初步筛选山葡萄抗霜霉病种质的指标。