结球甘蓝雌蕊调控因子SPT与HEC1的克隆及相互作用分析

为研究SPT和HECs及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响, 以结球甘蓝自交不亲和系E1为材料, 提取雌蕊总RNA, 根据拟南芥中SPT和HEC1基因设计引物, 采用同源克隆的方法克隆SPT基因, 其序列1085 bp, 开放阅读框(ORF) 1062 bp; HEC1基因ORF 696 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列表明, SPT编码353个氨基酸残基, 预测分子量为37.67 kD, pI为6.83; HEC1编码231个氨基酸残基, 预测分子量为25.26 kD, pI为10.2。分析表明, 两基因在各器官中均表达, 但SPT在果实和雌蕊中表达量最高, 而HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用, 构建原核表达质粒pCold I-SPT和pGEX-HEC1, Pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1及互换载体pGBKT7-HEC1和pGADT7-SPT酵母表达载体, 分别转化酵母Y2HGold和Y187感受态细胞后均未出现自激活和毒性现象, 融合后的二倍体酵母均能在SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA板上长出蓝色菌斑, 表明SPT和HEC1能够相互作用激活下游的HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2报告基因, 酵母双杂交试验结果与Pull-down检测一致, 说明SPT和HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。     

结球甘蓝雌蕊发育调控因子SPT与HEC1的基因克隆及相互作用

为研究SPT和HEC及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响,以结球甘蓝自交不亲和系E1为材料,提取雌蕊总RNA,根据拟南芥中SPT和HEC1基因设计引物,采用同源克隆方法克隆SPT基因,其序列1085 bp,开放阅读框(ORF)1062 bp;HEC1基因ORF 696 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列表明,SPT编码353个氨基酸残基,预测分子量为37.67 kD,pI为6.83;HEC1编码231个氨基酸残基,预测分子量为25.26 kD,pI为10.2。两基因在各器官中均表达,但SPT在果实和雌蕊中表达量最高,而HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用,构建原核表达质粒pCold I-SPT和pGEX-HEC1,pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1及互换载体pGBKT7-HEC1和pGADT7-SPT酵母表达载体,分别转化酵母Y2HGold和Y187感受态细胞后均未出现自激活和毒性现象,融合后的二倍体酵母均能在SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA板上长出蓝色菌斑,表明SPT和HEC1能够相互作用激活下游的HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2报告基因,酵母双杂交试验结果与Pull-down检测一致,说明SPT和HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。     

甘蓝、大白菜和甘蓝型油菜EXO70A1基因的克隆与表达特性

从甘蓝、大白菜与甘蓝型油菜中分离出EXO70A1基因,对该基因的序列进行生物信息学分析, 然后转化酵母Y187, 应用半定量RT-PCR检测BoEXO70A1基因的表达特性。结果表明, 3种芸薹属植物EXO70A1序列长度均为1 917 bp,相似性97.1%, 它们的gDNA序列均为单一序列,长度分别为3 797、3 752和3 770 bp,一致度达91.0%,均由12个外显子及11个内含子组成,除了第4、第5、第6、第8个内含子外,其余内含子的保守性低于外显子; 推导的3种蛋白质序列(BnEXO70A1、BrEXO70A1和BoEXO70A1)的相似度与一致性分别达99.8%与98.1%,其二级结构、三维结构及理化特性高度相似。EXO70A1基因的11个内含子的剪切位点均符合“GU-AG”法则,剪切受体(AG)的前20~50个碱基存在一段保守的序列“CU(A/G)A(C/U)”; 3种芸薹属植物与拟南芥EXO70A1基因的12个外显子的对应序列长度完全相同,所构成的编码区的序列一致性达90.1%,相应的蛋白质序列的相似度与一致性分别达99.8%与93.7%; 分子进化分析表明, EXO70A1在整个EXO70蛋白家族中及不同的植物间表现出较高的保守性; BoEXO70A1在酵母细胞Y187呈现弱表达; EXO70A1在甘蓝的雄蕊、幼茎、幼嫩花瓣、雌蕊、幼根及叶片中均能表达,可能属于组成型表达基因,但是其表达量在不同发育时期的不同器官中存在差异,授粉前雌蕊中最高,雄蕊中最低。由此可知,EXO70A1在芸薹属植物中整体高度保守, 但在酵母转化株和甘蓝各器官中的组成型表达有所差异,推测EXO70A1在植物细胞中具有多种重要的功能。     

小麦TaCIPK3与TaCBLs的互作分析

植物类钙调磷酸酶B蛋白CBLs(Calcineurin B-like proteins)和CBL互作蛋白激酶CIPKs(CBL-interacting protein kinases)在应答非生物逆境的钙信号系统中起着重要作用。为了研究小麦TaCIPK3的互作调控网络,以普通六倍体小麦(Triticum aestivum)品种矮抗58的叶片c DNA为模板,PCR扩增获得TaCIPK3的编码序列。TaCIPK3基因开放阅读框(ORF)长1348 bp,编码447个氨基酸。生物信息学分析显示TaCIPK3的N-端催化结构域含有CIPK家族蛋白的典型激活环,C-端调节域含有该家族高度保守的24个氨基酸NAF基序,具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的结构特征。利用酵母双杂交体系对TaCIPK3与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL3、TaCBL4、TaCBL6、TaCBL7、TaCBL9进行相互作用鉴定,发现分别转化有p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL1、p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta-CBL2、p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL3和p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL4的二倍体酵母菌能够在二缺培养基SD/-Trp/-Leu平板上长出白色菌落,同时这些二倍体菌株在四缺培养基SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-α-Gal/Ab A上能够长出淡蓝色菌落,表明下游的4个报告基因ADE2、HIS3、MEL1和AUR1-C被激活,因此说明TaCIPK3与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL3和TaCBL4之间存在互作。本研究结果对进一步研究TaCIPK3的生物学功能以及与TaCBLs的互作网络具有一定的参考作用。     

甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnFAD2基因的克隆、表达及功能分析

高油酸油具备较高的营养价值,在甘蓝型油菜中,脂肪酸去饱和酶基因(FAD2)是控制油酸含量的关键基因。本研究克隆了甘蓝型油菜A5、C5、A1连锁群上3个BnFAD2基因的全长cDNA序列,分别命名为BnFAD2-A5、BnFAD2-C5和BnFAD2-A1,各自编码384、384、136个氨基酸。分别使用TMHMM、Clust X软件分析FAD2基因的跨膜结构域和酶活中心表明,BnFAD2-A1不具备脱氢酶活性。采用酵母功能互补实验对4个基因(含已发表的BnFAD2-C1)进行功能验证,发现BnFAD2-A5和BnFAD2-C5基因去饱和能力接近,均大于BnFAD2-C1基因。采用qRT-PCR分析4个基因在甘蓝型油菜不同组织中的表达规律及血凝素标签法分析BnFAD2-C1、BnFAD2-A5和BnFAD2-C5的蛋白稳定性,表明BnFAD2-A5和BnFAD2-C5是影响油菜种子油酸积累的主效基因。     

(芥蓝×羽衣甘蓝)×白菜型油菜人工合成甘蓝型油菜研究初报

以芥蓝和黄籽羽衣甘蓝的杂种 F1 作母本与黄籽白菜型油菜材料杂交.开展了甘蓝与白菜间多变种复合杂交人工合成甘蓝型油菜初步研究.在4个种间杂交组合中,授粉后20天统计,发育子房率在31.5%～60.1%;每100蕾发育胚珠数为 1.1～60.8;借助胚珠培养获得了1个人工合成甘蓝型油菜新材料,其形态上综合了3个亲本的特征.该人工合成甘蓝型油菜自交高度不亲和,蕾期自交结籽也仅 1.8粒/花蕾;与天然甘蓝型油菜杂交表现较高的亲和性,杂交亲和性表现与天然甘蓝型油菜基因型有关.     

云南油菜(Brassica campestris)乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因的克隆及序列分析

本研究以云南小油菜为材料,克隆出乙酰辅酶A羧化酶的BCCP亚基基因,并对克隆基因进行生物信息学分析,结果表明云南小油菜BCCP基因含有6个外显子,编码258个氨基酸,有四个功能保守区,第四功能保守区是生物素化功能域,并且RT-PCR结果表明该基因是表达、有功能的。云南小油菜BCCP亚基与甘蓝型油菜Bp4的氨基酸序列相比较,有30个氨基酸发生变化;云南小油菜BCCP基因的ORF与甘蓝型油菜Bp4mRNA的同源性高达96%。     

一个甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因克隆和表达分析

利用甘蓝型油菜与播娘蒿融合杂种中的不育株与甘蓝型油菜杂交、回交,得到细胞质雄性不育系NJ65A。根据pol和nap雄性不育高度相关的基因orf224和orf222设计兼并引物,从NJ65A植株中克隆得到一个长度为675bp的基因,命名为orf224-NJ65A。该基因编码224个氨基酸,氨基酸序列与orf224、orf222和orf220序列相似性分别为：70％、53％、60％。RT—PCR表达分析表明：orf224-NJ65A在所检测的组织中都有表达,但在花、花蕾和茎中的表达量较大。推测orf224-NJ65A与细胞质雄性不育有关。     

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。     

甘蓝自交不亲和信号传导中SRK底物ARC1蛋白编码序列的克隆与分析

以甘蓝自交不亲和系20010197的植株为材料，提取幼苗中的gDNA及花蕾期的柱头、子房、花瓣、叶片、根的mRNA，并对mRNA进行反转录合成cDNA，然后以gDNA与cDNA为模板扩增ARC1蛋白编码序列。结果表明只在gDNA与花期柱头mRNA的反转录cDNA中扩增出产物，而在其他组织中无任何产物。这可能说明甘蓝ARC1蛋白编码序列是在柱头特异性表     

利用SNP分型技术鉴别油菜FLC1与FLC3基因的A、C组基因型

甘蓝犁油菜是由白菜型油菜(A组基因型)与甘蓝(C组基因型)杂交后自然加倍的异源四倍体芸薹属植物.其中含有A组与C组两种基因型的染色体,而FLC1与FLC3是A、C组中共同拥有的FLC基因.通过序列比对,分别寻找出A、C组基因中FLC1与FLC3基因的特异性SNP位点,并设计了3对SNP特异性引物对.采用特异性引物延伸法,分别对来自白菜型油菜、甘蓝以及甘蓝型油菜的不同材料进行检测.利用这3对特异性SNP引物对,成功地对油菜中A、C组的FLC1与FLC3基因进行了有效的分型,为研究甘蓝型油菜中A、C组来源的FLC1与FLC3表达奠定了基础.     

甘蓝型油菜热激蛋白HSP70基因家族的鉴定和分析

热休克蛋白也称热激蛋白(heat shock protein, HSP),是植物在受到生长环境中不利的生长因子胁迫时产生的一种用于抗逆的防御蛋白,其中在生物体中分布最普遍的一种热激蛋白是热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70)。为全面、深入地了解芸薹属HSP70基因家族的信息,本研究对芸薹属的3个物种(白菜,甘蓝和甘蓝型油菜)进行了生物信息学分析,首先在BRAD数据库中对芸薹属的3个物种进行HSP70基因数目的鉴定,分别在白菜和甘蓝中鉴定出了2个HSP70,在甘蓝型油菜中鉴定出了4个HSP70。将鉴定出来的这8个HSP70基因进行生物信息学分析(系统发生关系,基因结构,保守基序,染色体定位和同源性等),结果显示,芸薹属HSP70基因结构相似,在核酸和蛋白水平均具有高度保守性,进化过程中基本种之间以及天然杂交种与基本种之间均保持着极高的同源性,进化树以及其他生物信息学分析结果还表明甘蓝型油菜的HSP70位点与白菜、甘蓝的HSP70位点符合"禹氏三角"理论,但是根据3个物种的HSP70基因数量及对应关系等分析结果可推测白菜、甘蓝、甘蓝型油菜3个物种的HSP70位点与三倍化理论不完全一致,此结果可反映芸薹属的这3个物种在进化过程中其HSP70基因在数量或结构上发生过变化,致使其不满足三倍化学说。     

甘蓝型油菜及其亲本物种甲基化酶I基因的克隆及表达模式

DNA甲基化作为一种表观遗传调控方式,在植物体生长发育中起重要作用,而甲基转移酶I(DNA methylase I,MET1)在甲基化过程中起主要作用。本研究克隆到5个油菜Bn MET1同源基因,并比较了白菜Br MET1、甘蓝Bo MET1和油菜Bn MET1同源基因的进化及其表达模式。结果显示,白菜和甘蓝MET1同源基因在进化中较为保守,而油菜Bn MET1基因结构发生较大改变;部分油菜Bn MET1同源基因表达发生沉默,而激活表达的Bn MET1表达模式较其亲本白菜和甘蓝直系MET1同源基因发生明显的改变。上述结果表明,Bn MET1同源基因通过改变基因结构以及表达模式影响油菜组织中Bn MET1基因剂量,从而调节油菜的生长发育。     

结球甘蓝类钙调素蛋白基因BoCML39的克隆与表达分析

类钙调素蛋白作为钙调素蛋白的家族之一,调控植物生长发育、激素调控、病原菌防御及各种胁迫。本研究以结球甘蓝为试验材料,通过克隆获得BoCML39基因,其开放阅读框(ORF)为510 bp,编码169个氨基酸,不含内含子。预测BoCML39蛋白分子量为19.25 k D,等电点为4.35,为亲水蛋白,含有4个EF-hand结构域;系统发育树表明结球甘蓝BoCML39蛋白与白菜CML39蛋白处于同一进化枝,与油菜CML39蛋白、甘蓝CML39蛋白的亲缘关系近;三级结构预测发现该蛋白包含9个α-螺旋结构、5个β-转角、2个β-折叠、7个无规则卷曲和4个似小球状的钙离子结构。qPCR表明干旱(PEG6000,150 g/L)、盐(NaCl,200 mmol/L)、低温(4℃)、高温(37℃)、过氧化氢(H2O2,30 mmol/L)、脱落酸(ABA,100μmol/L)、水杨酸(SA,2 mmol/L)、茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol/L)不同处理条件均能上调结球甘蓝叶和根中BoCML39的表达。研究结果初步证实BoCML39基因响应逆境胁迫(PEG6000,Na Cl,4℃,37℃)、活性氧(H2O2)和激素(ABA,SA,MeJA)调控,为Bo CML39参与植物逆境、活性氧和激素调控信号途径及其功能研究提供科学依据。     

甘蓝型油菜磷脂二酰甘油酰基转移酶(BnPDAT1) cDNA的克隆和功能鉴定

磷脂二酰甘油酰基转移酶(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase, PDAT1)是植物三酰甘油(triacylglycerol, TAG)合成的关键酶。本文在甘蓝型油菜湘油15号cDNA中克隆到3个PDAT1全长编码序列(coding sequence, CDS), 经比对分别定位于A02、A10、C09染色体, 分别命名为BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDAT1-C09, 其序列长分别为1998、2002和2005 bp, 各自编码665、666、667个氨基酸。预测BnPDAT1基因编码蛋白定位于细胞质膜, 具有典型的PDAT1保守结构域。多序列比对和进化分析表明BnPDAT1基因编码蛋白与甘蓝、拟南芥、亚麻芥PDAT1蛋白具有较高的同源性。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有PDAT1酶活性。BnPDAT1基因在湘油15号中的表达现先上升后降低趋势, 在开花后25~30 d达最大值, 但3个拷贝的表达变化规律存在差异。     

芸薹属VFB4基因家族的生物信息学分析

为了探究芸薹属甘蓝型油菜(B. napus)、白菜(B. rapa)、甘蓝(B. oleracea) 3个物种的进化关系,本研究利用生物信息分析学的方法,测定芸薹属VFB4基因成员的氨基酸序列,染色体定位和二级结构。利用VFB4基因在染色体上的位置,绘制出染色体定位图和3个物种的进化系统发育树,并对3个物种的亲缘关系进行讨论。结果显示,芸薹属VFB4基因编码的氨基酸数在524~534之间,均为亲水蛋白,亚细胞定位均在细胞核中。VFB4基因不含内含子,GC含量很高,但是在染色体上分布不均匀。系统进化发育树分析得出,芸薹属物种间的同源性非常的高,种内的同源性不是很高。通过对基因的对比分析发现,芸薹属VFB4位点符合禹氏三角理论,但是不完全符合芸薹属三倍体进化学说。本研究结果可为进一步研究芸薹属基因进化提供科学依据。     

野芥芥酸合成酶基因fae1的克隆与序列分析

根据GenBank中脂肪酸延长酶基因fae1序列(AY 888037)设计了PCR扩增引物,以野芥总DNA为模板进行扩增得到了特异扩增条带.测序结果表明,该片段长1 651 bp,序列分析表明其氨基酸编码区为55～1 575 bp,不含内含子序列,共编码506个氨基酸.该基因序列已提交GenBank,登录号为FJ870905.BLASTn分析结果表明,野芥中fae1基因与其他芸薹属品系的fae1基因核苷酸同源性为76%～98%;BLASTp分析结果表明,野芥中的FAE1与油菜中FAE1存在32个位点差异,其中部分差异可能导致了芥酸含量的不同.     

甘蓝自交不亲和性信号传导元件与传导过程

甘蓝自交不亲和性是由多态性的S位点基因编码的蛋白质介导的信号传导途径实现的。该信号传导途径由8个蛋白质元件(SLG、SCR、SRK、MLPK、THL、ARC1、Exo70A1和MOD/MIP-MOD)组成,本文详细综述了这些元件的编码基因、蛋白质元件的结构和功能,以及元件间的相互作用所构成的信号传导过程。在此基础上,根据新进展提出了今后可能的研究重点,以期为包括甘蓝在内的芸薹属自交不亲和性的深入研究提供新的内容。