大豆GmGRF5基因的组织表达模式与生物信息学分析

Growth Regulating Factor (GRF)家族基因是一类植物特有的转录因子,广泛参与植物多个重要的发育过程。为了研究大豆中的GRF转录因子的功能,本研究从大豆‘天隆1号’品种中克隆获得全长为1 038 bp的cDNA序列,由于该序列的编码蛋白与拟南芥GRF5具有高度的相似性,因此将其命名为GmGRF5基因。通过RT-PCR进行组织部位表达分析,发现GmGRF5基因在大豆各个组织部位均有表达,且在花中的表达量最高。通过ExPASy-Protparam分析发现,该蛋白质的分子量为39.463 48 kD,是具有一定亲水性、不稳定的碱性蛋白。该蛋白含有GRF家族蛋白的两个保守功能域(QLQ和WRC)。利用SOPMA对该蛋白的二级结构预测,显示其主要由无规则卷曲(72.05%)、α-螺旋(13.83%)、延伸链区(9.8%)和β-转角(4.32%)组成。此外,还利用不同的生物信息学软件对其三级结构、跨膜域、亚细胞定位、互作蛋白进行了分析,并构建系统进化树。结果表明,Gm GRF5基因在进化过程中具有高度的保守性,在大豆中具有潜在的功能多样性。     

大豆GmNAC23基因的克隆及特征分析

NAC是一类植物特异性转录因子,其在调节非生物和生物胁迫的发育和响应中起重要作用。为了探索大豆相关基因的功能,利用PCR的方法从大豆中克隆了1个NAC基因GmNAC23。该基因c DNA全长1 077 bp,开放阅读框长1 053 bp,编码350个氨基酸,蛋白质分子量为39. 483 ku,等电点为7. 08。序列分析表明,GmNAC23基因组包含3个外显子和2个内含子。多序列比对结果表明,GmNAC23蛋白含有1个高度保守的NAM结构域。进化树分析表明,该蛋白与绿豆、木豆、鹰嘴豆的NAC蛋白具有同源关系。转录活性分析结果表明,GmNAC23在SD (Trp-/His-/Ade-)营养型缺陷培养基上生长,说明该基因在酵母体内具有转录激活功能。组织特异性表达模式分析表明,在检测的所有组织中GmNAC23都有表达,在根中表达量最高,在茎顶端分生组织中表达量最低。结果表明,大豆GmNAC23基因具有转录激活功能,并且其在根中大量表达。为进一步研究GmNAC23的生物学功能奠定了基础。     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝（Ganoderma lucidum）金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3’端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp（包括一个终止密码子）,可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸Ser(S)和丙氨基酸Ala(A),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

芝麻中一个富含脯氨酸新基因的克隆与特征分析

芝麻青枯病是影响我国南方芝麻产量及品质的重要病害。该病属细菌病害,由青枯雷尔氏菌引起。本研究利用随机引物对芝麻受青枯雷尔氏菌诱导前后进行基因差异表达分析,发现一个诱导明显下调的基因(片段)。将该片段克隆、测序后,在芝麻基因组数据库中比对其序列,得到一个ORF完整的全长基因。序列分析表明该基因无内含子,ORF长度为1458 bp,编码486氨基酸,其N端富含脯氨酸及富含脯氨酸的重复序列,属于富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein,PRP),将其命名为Si PRP(Sesamum indicum proline-rich protein)。根据该基因ORF两翼序列设计引物在芝麻c DNA中克隆到该基因,测序结果与预测序列一致。Blast分析表明该基因编码蛋白与其他植物中发现的PRP蛋白同源性很低,且其富含脯氨酸的重复序列在其他植物中也未发现,推测为一个新型富含脯氨酸蛋白。进一步设计基因专化的定量及半定量PCR引物进行其诱导表达分析,再次证明该基因受病菌诱导后下调表达。与其他植物中发现的大多数PRP蛋白定位于细胞壁不同,Si PRP主要定位于细胞膜,少量可以分泌到细胞外。烟草表皮细胞瞬时表达显示该蛋白定位在细胞膜上的特殊结构,推测该蛋白在芝麻和青枯雷尔氏菌的互作中发挥重要作用。     

马氏珠母贝TLR2基因cDNA的分子特征及组织表达分析

TLR2（toll like receptor 2）是TLR模式识别受体家族的重要成员之一,参与有机体的免疫识别。本研究采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得了马氏珠母贝（Pinctada martensii）TLR2基因（PmTLR2）cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时检测了PmTLR2基因的mRNA在马氏珠母贝六个组织中的表达。结果表明：PmTLR2基因的cDNA全长2614 bp,包含41 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR,27 bp的polyA,开放阅读框为2274 bp,编码758个氨基酸残基。多序列比对显示PmTLR2与牡蛎TLR2的序列相似性最高,为51%;Smart软件分析显示PmTLR2的蛋白序列中含有8个亮氨酸重复序列（Leucine rich repeats,LRRs）, 1个C端亮氨酸富集区（Leucine-rich repeat C-terminal,LRR-CT）,1个N端亮氨酸富集区（Leucine-rich repeat N-terminal,LRR-NT）,1个TIR（Toll/IL-1R）同源结构域（TIR）;荧光定量PCR分析表明PmTLR2在马氏珠母贝肝胰脏、性腺、血淋巴、鳃、外套膜和闭壳肌六个组织中均有表达,鳃中表达量最高。本研究为进一步阐述PmTLR2在马氏珠母贝免疫应答中的作用机制提供理论基础。     

油用牡丹PsFAD6基因的克隆与表达分析

本研究以油用牡丹(Paeonia suffruticosa)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR的方法克隆得到油用牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(ω-6 FAD)基因cDNA全长,命名为PsFAD6(GenBank登录号:KY233120)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 819 bp,其中开放阅读框1 326 bp,编码441个氨基酸,3'端非编码区长271 bp,5'末端非编码区长192 bp;多序列比对表明,油用牡丹PsFAD6氨基酸序列含有3个保守结构域,系统发育分析显示油用牡丹与葡萄处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PsFAD6蛋白无信号肽,具有3个跨膜域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性分析表明,PsFAD6在油用牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶片中表达量最高,雄蕊次之,在雌蕊中表达量最低;不同发育时期种子中,80 d表达量最高,60 d次之,在20 d中表达量最低     

茉莉花MK基因及启动子克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶在植物萜类化合物合成中具有重要作用。本研究以茉莉花转录组测序数据为基础,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从双瓣茉莉花中获得甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)基因,命名为JsMK(GenBank登录号为MH311040)。测序结果显示JsMK全长cDNA为1608 bp,包含开放阅读框(ORF)1164 bp,编码387个氨基酸。生物信息学分析结果表明该基因编码的蛋白可能定位于细胞质中,为非亲水性稳定蛋白,含有与其他MK蛋白所共有的3个保守区,以及GHMP家族特有的N端保守区和C端保守区。Blast比对和系统进化树分析结果表明,JsMK蛋白与野生油橄榄、长春花等多种植物的MK蛋白同源性较高。采用染色体步移技术(Genenome walking technique)扩增MK基因5’端上游调控序列,获得709 bp启动子序列,PlantCare分析表明该序列含有大量基本顺式作用元件TATAbox、CAATbox,还存在生长素(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)等激素响应激素及多个光响应顺式调控元件。利用实时荧光定量PCR检测Js MK在IAA、MeJA、ABA处理下的表达水平。结果表明,JsMK同时受IAA、MeJA及ABA不同程度的诱导表达,其中MeJA对其诱导最明显。本研究通过从茉莉花中克隆并分析JsMK基因及其启动子序列,为进一步研究JsMK基因在萜类合成调控的功能提供科学依据。     

甘蓝型油菜2个GPAT6同源基因的克隆与表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)是三酰甘油生物合成的关键酶,催化三酰甘油合成的起始步骤,在植物中参与调节生长发育、脂质的合成和逆境应答等过程。本试验通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种湘油15中克隆得到GPAT6基因的2个拷贝,分别命名为BnGPAT6-1(GenBank登录号为KJ000117)和BnGPAT6-2(KC106728)。它们的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)均为1506 bp,编码501个氨基酸。预测其蛋白结构N端含有一个类卤酸脱卤酶(haloacid dehalogenase-like hydrolase,HAD-like)活性结构域,C端含有一个溶血磷脂酰基转移酶(lysophospholipid acyltransferase,LPLAT)功能域。蛋白序列比对和进化树分析表明,甘蓝型油菜与白菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和琴叶拟南芥(A.lyrata)中的GPAT6序列相似性最高。组织表达结果表明BnGPAT6基因在花中的表达量最高,在未成熟的胚中表达量呈先升高后降低的趋势。BnGPAT6的表达受ABA的抑制;在干旱和6-BA胁迫下几乎同时升高;在盐胁迫下,短时间内升高,达到峰值后降低;在水渍条件下没有明显变化。     

两个棉花HyPRP基因的分子鉴定与初步表达分析

从棉花胚珠和纤维cDNA文库中分离了2个编码杂合的富含脯氨酸的细胞壁蛋白（hybrid proline-rich protein, HyPRP）基因,命名为GhHyPRP1和GhHyPRP2,其编码蛋白分别含有327和137个氨基酸。蛋白质结构分析表明,二者都含有: N-端信号肽区、富含脯氨酸结构域、和C-端含有特定排列顺序和数目的半胱氨酸结构域。根据蛋白质结构域组成特点及与其他多结构域的富含脯氨酸蛋白质序列的同源性比较分析,将GhHyPRP1归为HyPRP A类蛋白质,将GhHyPRP2归为HyPRP B类蛋白质。RT-PCR分析显示GhHyPRP1在幼苗下胚轴中大量表达,而GhHyPRP2在胚珠中优势表达,暗示这2个基因可能分别在棉花不同组织发育中具有一定的生物学功能。     

油菜油体钙蛋白基因BnClo1的克隆和表达

应用同源序列克隆法设计同源简并引物,结合RT-PCR和RACE-PCR技术从甘蓝型油菜中分离克隆了编码28.1 kD油体钙蛋白( caleosin)的基因BnClo1。其全长1 058 bp的BnClo1 mRNA( GenBank中序列号为AY966447)包含完整的开放阅读框和3＇末端Poly( A)尾巴结构,染色体DNA结构上含6个外显子和5个内含子。Northern杂交结果表明油菜中BnClo1在种子形成中期开始丰富表达,在种子形成后期,即种子开始脱水成熟时期,高量稳定地表达。半定量PCR结果显示BnClo1在油菜种子吸水膨胀后前2 d的茎中明显表达。证明在油菜种子发育期间,BnClo1对mRNA的转录表达是由胚胎发育来调控的,具有显著的时空特性,并与油体的形成和积累密切有关。推测的caleosin蛋白为245个氨基酸残基( GenBank中序列号为AAY40837)组成的两性蛋白质,主要含3个结构域即由N末端1~16位氨基酸残基组成的α-螺旋和17~61位氨基酸残基组成的强亲水性的随机卷曲构成的N-末端亲水性结构域;由80~120位氨基酸残基组成的中间疏水性结构域和C-末端亲水性结构域。N-末端亲水性结构域包含一个潜在的结合Ca²⁺的EF-手结构。中间疏水性结构域包含一个潜在的脯氨酸-结( Proline-Knot)模体,在92~114位氨基酸残基组成的α-螺旋跨膜区域,推测在caleosin蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上及增加种子油体的稳定性上起着重要的作用。     

柽柳冷适应蛋白基因

冷适应蛋白(CAP)是指生物体受到寒冷刺激后,诱导表达的一类特异蛋白质,由冷诱导有关的基因在冷诱导过程中启动转录和翻译的。低温条件下,冷适应蛋白表达量在持续不断增加,对低温条件下蛋白质合成的调节以及mRNA的折叠起重要作用。是一类重要的与细胞耐寒相关基因。我们从构建的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)cDNA文库中分离得到了冷适应蛋白基因片段,并应用RACE技术获得其全长cDNA序列,该基因cDNA序列长度为1176bp,其中开放读码框(ORF)从49到663碱基位置,长度为615bp,编码204个氨基酸组成的多肽,预测其蛋白质分子量为23kD,预测其理论等电点为9.23。该基因已经在GenBank上注册,其基因序列登录号AY587773,氨基酸序列登录号为AAT01418。该基因的克隆为植物分子育种提供了新的基因资源。     

棉花GhRGL基因克隆及其原核表达研究

GA信号转导途径是通过DELLA蛋白来抑止的。通过对Genbank进行Blast比较,我们首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DELLA蛋白一样的保守结构域,我们对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21（DE3）菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白, 大小约为64kDa。首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达, 为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础。     

柞蚕核型多角体病毒p11基因克隆及序列分析

为丰富柞蚕核型多角体病毒分子生物学基础,通过PCR扩增克隆了ApNPV p11基因并进行了序列的生物信息学分析.ApNPV p11基因编码102个氨基酸,预测分子量11.2 kDa;氨基酸序列N端1～33位是信号肽序列,中部50～72位是跨膜区.PSI-BLAST搜索表明有20种核型多角体病毒编码蛋白与ApNPV P11蛋白有显著性匹配;比对分析发现P11蛋白氨基酸序列中部相对保守,两端变异较大.进化分析表明ApNPV属于NPV类群Ⅰ且与EppoNPV、AgMNPV、CfDefNPV亲缘关系较近.     

本生烟脂质转移蛋白基因克隆及VIGS沉默载体和过量表达载体构建

非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer proteins,nsLTPs)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能。为研究nsLTPs在调控植物应答生物与非生物胁迫的反应中起的作用,本研究以本生烟(Nicotiana benthamiana)为材料,成功克隆非特异脂质转移蛋白NbLTP1全长基因,其开放阅读框序列为360 bp,编码119个氨基酸,分子重量为12.44 kD,为疏水性蛋白,等电点为7.45。对NbLTP1蛋白质三级结构进行了预测和分析,并进一步构建了烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的病毒诱导的基因沉默载体TRV:NbLTP1。荧光定量PCR结果表明通过VIGS可以显著抑制NbLTP1基因的表达。此外还通过In-Fusion克隆技术快速成功构建了pCAMBIA1305-NbLTP1-3*HA过量表达载体。本研究为下一步遗传转化、后续研究NbLTP1调控植物防御生物与非生物胁迫的分子机理、培育新种质提供理论依据。     

小麦小G蛋白Tarab5B基因全长cDNA克隆及表达特性的初步分析

通过对白粉病菌诱导的小麦叶片cDNA文库的测序,获得1个与水稻Rab5B基因一致性达89%的序列.以该序列为信息探针,筛选小麦EST数据库并进行电子拼接.根据拼接结果设计引物,利用RT-PCR方法获得了1个小麦中尚未鉴定的全长cDNA克隆Tarab5B.Tarab5B基因编码的蛋白具有结合GTP/GDP的4个保守结构域以及Rab家族成员所特有的结构域.同源分析表明,该基因属于Rab5B亚族.麦类Rab5B蛋白的GDSGVGKS、DTAGQE、NKAD、ETSA和MGCSSS 5个结构域在进化上非常保守,而YYRGA结构域及其邻近的C端6个氨基酸残基在小麦材料间同源性很低.RT-PCR检测显示,抗、感两个材料Tarab5B基因在接种后24 h和未接种24 h的表达水平基本相同;在接种后1 h、4 h、7 h、12 h,抗、感两个材料间Tarab5B基因的表达水平有一定差异.