稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选

利用农杆菌T-DNA介导的遗传转化体系转化稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)Y34菌株,平均每转化1.0×106个稻瘟病菌分生孢子可得到约300个抗潮霉素菌株。用该转化体系转化和筛选,获得抗潮霉素菌株6855个。PCR检测结果表明,所有表现抗潮霉素菌株均含抗潮霉素基因,说明抗潮霉素特性是T-DNA携带潮霉素基因插入Y34基因组的表型效应,即抗潮霉素菌株是T-DNA插入突变体。对56个突变体DNASouthern检测结果表明,有27个突变体是单拷贝插入,突变体T-DNA插入拷贝数平均为1.43。随机取1600个突变体进行致病力测定,结果发现23个突变体完全丧失致病能力。     

马铃薯薯形突变体T-DNA插入侧翼序列分析

以‘鄂马铃薯3号’为材料,通过试管薯快速转基因技术获得一个编号为pCL2b-2薯形突变系,本研究通过表型鉴定、侧翼序列扩增和生物信息学等方法对其进行了研究,目的是分析该突变株表型变化控制机制。结果表明,该突变体的试管薯和温室收获块茎长宽比在p<0.05水平均显著大于野生型受体薯,其中试管薯长宽比为1.78,野生型试管薯长宽比为1.33;温室收获块茎长宽比为1.50,野生型块茎为1.29;利用hiTAIL-PCR技术对T-DNA插入位点两侧的侧翼序列分析表明,T-DNA插入编码异戊烯基转移酶(IPT)基因内部,该基因为细胞分裂素合成酶基因(StIPT),暗示StIPT基因可能参与马铃薯薯形发育。     

茶小绿叶蝉危害乌龙茶茶树品种的挥发物分析

为明确茶小绿叶蝉危害不同抗性茶树品种后挥发物的变化,从而为抗虫茶树品种的选育提供依据,本研究选择小绿叶蝉危害虫口密度最大和最小的乌龙茶茶树品种肉桂和铁观音为材料,以GC-MS为研究手段,进行茶树组成型和虫害诱导型挥发物的测定和分析。结果表明,邻异丙基苯甲烷、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、α-法呢烯、γ-萜品烯和3-甲基-2-环己烯-1-酮为铁观音和肉桂的主要组成型挥发物成分。2个品种在健康茶树挥发物的成分组成和各组分的含量上都存在差异。芳樟醇只在铁观音的健康茶梢中被检测到,而十三（碳）烷、乙酸辛酯、十六烷和雪松醇只在肉桂的健康茶梢上检测到。β-月桂烯、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯和α-法呢烯在铁观音上的含量远远大于肉桂。另一方面,茶树受小绿叶蝉危害一段时间后,铁观音和肉桂在挥发物组成和含量上产生了较大的变化。二者都释放大量的β-月桂烯、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、α-法呢烯和芳樟醇,在危害4 h和8 h的挥发物测定中,2个品种的这些成分较危害前的增加量从1.49倍到41.22倍。此外,茶小绿叶蝉的危害还诱导了新的挥发物的产生,包括(Z)-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯和苯乙醇。(Z)-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯、苯乙醇、β-月桂烯、β-罗勒烯、反式- β-罗勒烯、α-法呢烯和芳樟醇,这10种挥发性物质可能跟茶树的诱导抗性和铁观音的抗虫性有关。     

胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析

利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杞果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4 680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传.随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2 kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起:进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入.     

油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化（ATMT）油菜黑胫病菌L. biglobosa菌株Lb731的因素,评估转化子质量,并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素：潮霉素B浓度为50 μg/mL,转化受体（分生孢子）培养时间为15 d (20℃),浓度为2 × 10^7~8孢子/mL,农杆菌-受体共培养温度为25℃,共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%,单拷贝插入频率为72.7%,转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体,7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体,并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术,从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。     

3个不同罗勒种叶中香气成分的GC-MS分析

利用GC/MS技术分析罗勒(Ocimum basilicum L.)、台湾罗勒(Ocimum tashiroi Hayata)和丁香罗勒(Ocimum gratissimum)成龄叶的香气成分。结果表明：3个罗勒品种的叶片中香气成分的种类和含量存在明显差异：罗勒中检出37种香气物质,占其总挥发性物质的91.15%;台湾罗勒中检出21种香气物质,占95.08%;丁香罗勒中有29种,占89.49%。其中,烃类和醇类2类化合物在3种罗勒叶片中分别占挥发物总量的84.39%、78.61%和77.88%。β-蒎烯是3种罗勒共有的主要香气成分,桉树脑、茴香脑和环葑烯则分别是罗勒、台湾罗勒和丁香罗勒的主要香气成分。     

橡胶树胶胞炭疽菌T-900突变体生物学研究及其假定基因LV1敲除载体构建

从构建的橡胶树胶孢炭疽菌RC178(Colletotrichum gloeosporioides)突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱突变体T-900,与野生菌株相比其菌落生长速率、产孢能力,孢子萌发率及附着孢形成率均明显降低。通过对突变菌株T-900 T-DNA侧翼序列克隆、比对和基因预测结果表明外源片段的插入破坏了一个预测基因的功能,该基因和组蛋白H3同源性为99%,暂命名为LV1。通过同源臂克隆构建了该基因敲除载体900-1A-900-1B-p CT74,为进一步研究该基因在病原菌致病过程中的作用机理提供了基础。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

水稻小粒矮突变性状与T-DNA插入标签的共分离检测

 从T-DNA水稻标签系中发现1个标签系中出现了小粒矮(sgd)突变性状的分离。为克隆该突变基因和进行基因功能研究,对该突变体进行了遗传分析。该标签系存在多个插入事件,且T3代发现目标突变性状分离系中,另一个非目标插入事件已经纯合,故特异PCR检测不能确认小粒矮突变性状与T-NA插入共分离。但通过TAIL-CR方法,获得了插入点侧翼的水稻基因组序列,并证实该侧翼序列与小粒矮突变性状共分离。     

橡胶炭疽病菌致病相关突变体的筛选及表型分析

通过对实验室已获得的1 685个橡胶炭疽病菌T-DNA插入突变体的生物学及致病性测定,从中筛选出15个致病力明显减弱的突变体,并进行PCR检测。结果表明,该基因组中均含潮霉素磷酸转移酶基因片段。在PDA培养基上,其中2个突变体菌落颜色异常,6个生长速率下降,8个产孢量显著降低,2个突变体分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞,在洋葱表皮上,侵染钉形成率显著降低。     

黄牛木果实挥发油的化学成分研究

采用气相色谱-质谱联用技术GC-MS对黄牛木[Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume]果实挥发油的化学成分进行分析,共鉴定出46种化合物,占其总量的95.361%。在已鉴定的46种化学成分中,含量较高的成分依次为β-石竹烯(24.060%)、油酸(14.629%)、反式-β-罗勒烯(11.572%)、石竹烯氧化物(11.447%)、α-蒎烯(7.540%)。     

甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位

由镰孢菌复合种引起的甘蔗梢腐病（pokkah boeng disease, PBD）是甘蔗的主要病害之一。在广西,甘蔗镰孢菌（Fusarium sacchari）是PBD的优势病原菌。尽管PBD的研究已有较长的历史,但甘蔗镰孢菌的致病分子机理远未得到阐明。为研究甘蔗镰孢菌的致病分子机理,本研究采用农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）技术构建甘蔗镰孢菌FF001菌株的T-DNA插入突变体库。采用携带潮霉素B磷酸转移酶基因pTHR1-AH双元载体的农杆菌菌株AGL-1介导转化F. sacchari分生孢子,获得3018个转化子;随机选取12个转化子进行PCR检测和Southern杂交分析,结果显示所有检测突变株均插入潮霉素B磷酸转移酶基因,多数为单拷贝插入。采用离体叶片接种评价转化子的致病力,获得致病力明显减弱21个和致病力增强9个,共30个突变体。通过TAIL-PCR扩增测序并与甘蔗镰孢菌基因组序列比对,确定了其中27个突变株的T-DNA插入位点。观察到多个插入位点伴随有基因组片段缺失,导致1...     

橡胶树转HbCBF1基因矮化突变体T-DNA插入位点研究

利用经PCR、GUS染色和Southern杂交均证明已成功转入Hb CBF1的、田间表型为矮化的橡胶树植株C1为材料,通过TAIL-PCR的方法获得T-DNA右侧侧翼序列1.6 kb,根据侧翼序列与载体的序列设计引物分析验证该序列真实可靠,并设计引物判断基因的T-DNA插入以杂合位点存在,与此同时,将该侧翼序列与已有的橡胶树基因组测序结果进行比对分析,发现该插入位点处并不存在基因,根据CBF1与Ca MV35s启动子的研究推测,C1植株的矮化表型是由于Ca MV35s启动子驱动抗逆基因导致,而非插入基因造成。     

SPME/GC-MS法分析不同龙眼品种果实中的香气成分

采用 SPME/GC-MS法对4个龙眼品种果实香气成分进行了分析鉴定。结果表明，4个龙眼品种共检测出44种芳香物质，其中烷类11种，烯类18种，酯类10种，醇类3种，酮类1种，炔类1种，它们构成4种龙眼主要的香气成分。4个龙眼品种在香气组成和含量上有所差异，储良、东良、东丰、石硖中分别含有25种、24种、26种、21 种香气成分。其中，4种龙眼共有的香气成分有7种：分别是十七烷、罗勒烯(顺式)、罗勒烯(反式)、别罗勒烯、1,3,8-对-薄荷三烯、α-石竹烯、(E)-β-金合欢烯，但其相对含量都有所差异；此外，各品种也具有自己独特的香气成分，如储良特有的香气成分有9种：包括十六烷、2-甲基-4-亚甲基-5 -(2,2-二甲基环丙基)-1-戊烯、5-环丙基戊酸乙酯、二十酸乙酯、棕榈酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、香叶基芳樟醇、芳樟醇、2,7-二甲基-3-辛烯-5-炔；东丰特有的3种：包括1-碘十一烷、反式，反式-法尼基酸甲酯、2-羟基十二烷酸甲酯；石硖特有的4种：包括十一烷、(-)-异丁香烯、1,3,3-三甲基-2-乙基环己烯、喇叭茶醇；东良没有特有的香气成分。     

胡椒叶片挥发性成分HS-SPME-GC/MS分析

以胡椒属种质蒌叶、墨西哥胡椒、假荜拔为材料,利用顶空固相微萃取-气相色谱和质谱联用（HS-SPME-GC/MS）技术测定3种种质叶片中的挥发性成分及用面积归一法计算其相对含量。结果表明：鉴定出蒌叶、墨西哥胡椒、假荜拔的挥发性成分59种,其中从蒌叶中共鉴定出挥发性成分36种,其含量较高的有安息香醛、荜澄茄油烯和β-石竹烯,相对含量分别为23.56％、9.36％和8.54％;从墨西哥胡椒中鉴定出挥发性成分18种,其中含量较高的有肉桂醛、萜品烯和萜品油烯,相对含量分别为77.98％、5.88％和5.11％;而假荜菝叶片挥发性成分有25种,含量较高的有β-石竹烯、罗勒烯和芳樟醇。挥发性成分的种类在3种胡椒属种质中都不相同,总的相对百分含量也不同,说明不同的种质,叶片挥发性成分有一定的差异。     

不同成熟度菠萝果实香气成分分析

用菠萝巴厘品种8成熟和9成熟的果实为材料,采用顶空同相微萃取法(HS-SPME)提取其中的香气成分,并经气相色谱,质谱(GC/MS)联机分析.结果显示,在8成熟果实中检测到13种香气成分,其中酯类10种,烯类2种,苯类1种;在酯类中,相对含量最高的是己酸甲酯(50.89%),其次是己酸乙酯(16.11%)、2-甲基丁酸甲酯(8.68%)、辛酸甲酯(5.23%)和辛酸乙酯(2.40%);检测到2种烯类成分,分别为(E)-3,7-二甲基-1,3,6辛三烯(5.18%)和à-蒎烯(0.65%);还检测到甲苯(0.32%).在9成熟果实中检测到2类共27种香气成分,分别是酯类17种和烯类10种:在酯类中,相对含量最高的是辛酸甲酯(25.27%),其次是辛酸乙酯(21.00%)、己酸乙酯(17.64%)、己酸甲酯(14.34%);在烯类中相对含量较高的有β-顺式-罗勒烯(1.00%)、à-蒎烯(0.81%)和反式-罗勒烯(O.48%).此外,仅在9成熟果实中检测到菠萝特征香气成分3-甲硫基丙酸甲酯,其相对含量为1.36%.说明9成熟菠萝果实香气成分比8成熟的丰富,且此时特征香气成分形成:如果非远距离运输,9成熟是鲜食菠萝的理想采收成熟度.     

转基因大豆插入位点分析及特异性PCR检测方法的建立

采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。     

两种转基因抗虫棉L280和L282外源基因插入位点的分析

为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明,它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时,为了获得侧翼序列,分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增,确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列,明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置,也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。     

两种转基因抗虫棉L280和L282外源基因插入位点的分析

为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明,它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时,为了获得侧翼序列,分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增,确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列,明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置,也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。