禽白血病／N瘤病毒群特异性抗原p27的分离纯化及其抗体的制备

采用细胞培养法增殖禽白血病／肉瘤病毒（ALV／RSV）A亚型，然后对其进行超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化病毒，再采用电泳分离与电洗脱收集相结合的方法纯化p27蛋白。经检测，提取的p27蛋白具有良好的抗原性与免疫原性。用该蛋白免疫家兔制备的兔抗p27抗体，经ELISA方法检测其效价可达1：6400以上。     

茶花鸡禽白血病病毒血清抗体的调查和p27抗原排毒规律的研究

为了解西双版纳地方品系茶花鸡禽白血病(Avian leukosis,AL)的感染情况及p27的排毒规律,试验应用ELISA法对395份茶花鸡血清样本进行ALV-A/B亚群和ALV-J亚群抗体检测;并对1,14,35,42,70,105日龄按翅号对应采集的泄殖腔棉拭子及238日龄按翅号对应采集的蛋清跟踪检测ALV p27抗原。结果表明:茶花鸡ALV-A/B亚群和ALV-J亚群抗体阳性率分别为5. 57%和35. 44%;跟踪调查发现,茶花鸡分别在1日龄和238日龄达到排毒高峰。说明1日龄和238日龄是茶花鸡AL净化的最佳检测时间。     

禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）p27抗原ELISA检测试剂盒（国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX）进行比较。结果显示：从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2～3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品（DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪）的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。     

禽白血病病毒p27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备

将禽白血病病毒p27基因克隆并构建重组表达质粒pET28a-p27,在大肠杆菌BL21中经IP TG诱导后产生可溶性表达蛋白。表达的蛋白用Western blot进行活性检测,其能与辣根过氧化物酶标记的兔抗p27抗体发生特异性反应;采用金属螯和层析对表达蛋白进行纯化,其纯度约为95％;用纯化的表达蛋白p27免疫家兔制备抗血清,ELISA抗体效价可达1∶25600。研究结果表明,大肠杆菌表达的p27蛋白具有良好的抗原性,可以替代纯化病毒蛋白用于禽白血病病毒检测。     

J亚群禽白血病病毒感染鸡的抗原和血清抗体变化规律

为了解鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)后抗原和血清中抗体的变化规律,本研究经卵黄囊途径对6日胚龄SPF鸡胚,肌肉途径对31日龄和56日龄的SPF鸡感染ALV-J后,于不同时间采集胎粪或泄殖腔棉拭子,同时采集血液、分离血清,以检测p27抗原、J型抗体和p27抗体。结果显示,胚胎组在各检测点均可检测到p27抗原(仅1只鸡在1日龄时为阴性),而31日龄组和56日龄组检测不到p27抗原;胚胎组没有检测到p27抗体,31日龄组中80%的鸡在3次重复感染后可检测到p27抗体,56日龄组在首次感染后p27抗体的检出率较高(60%);各组J型抗体在各检测点基本为阴性(仅个别鸡在个别检测点为阳性)。结果提示,p27抗原和抗体的检测在ALV-J感染的早期诊断及禽白血病净化工作中具有重要意义。     

龙岩市地方优良种禽原种场禽白血病p27抗原检测与分析

用酶联免疫吸附试验法对长汀河田鸡原种场、武平象洞鸡原种场、龙岩山麻鸭原种场共686份蛋清样本及801份泄殖腔棉拭子进行禽白血病p27抗原检测。结果为：龙岩山麻鸭的蛋清样本和泄殖腔棉拭子均未检出ALV核酸;鸡蛋清样本阳性率为12.8%（80/626）,明显高于泄殖腔棉拭子阳性率8.9%(66/741);鸡原种场180日龄蛋清样本和泄殖腔棉拭子阳性率均最高,平均阳性率分别为15.0%和11.3%。表明：龙岩市境内地方优良鸡原种场中有禽白血病感染现象。     

江西地方鸡禽白血病P27抗原消长规律的研究

随机选取1日龄崇仁麻鸡及东乡黑鸡(原种鸡)各92只,带翅号。于1、7、14、21、28、35、42、49、56、70、98、112、140、150、160、170、180、190、200、230、260、290、320日龄按号对应采集泄殖腔棉拭子进行ELISA检测ALV-P27抗原,查清崇仁麻鸡及东乡黑鸡禽白血病的排毒规律,找出最佳净化时机。结果显示:全群鸡在监测的320日龄内均有ALV感染发生,崇仁麻鸡与东乡黑鸡均在8周龄达到第1个排毒高峰,经过10周龄至12周龄ALV-P27阳性率降低之后,崇仁麻鸡与东乡黑鸡ALV-P27阳性率在20周龄再一次达到高峰,随后进入一个相对的平稳期。试验结果为种鸡场开展净化工作提供了科学依据。     

禽白血病病毒p27基因在毕赤酵母中的表达

为获得禽白血病病毒p27蛋白,利用DNA重组技术,将扩增的p27基因亚克隆至酵母表达载体pPIC9K中,并将制备的酵母表达质粒电转至毕赤酵母细胞GS115中,通过SDS-PAGE和Western blot技术检测p27蛋白在不同条件下的表达情况,同时对诱导表达条件进行系统的优化.结果表明,成功构建出pPIC9K-p27...     

鸡蛋和胎粪禽白血病病毒p27抗原检测试验

本试验选择某品种鸡的快羽系与慢羽系为试验群体,利用ELISA技术检测鸡蛋和胎粪中禽白血病病毒(ALV)p27抗原。试验结果显示:慢羽系鸡蛋中ALV p27抗原阳性率高于快羽系;检测重复鸡蛋数分别为1、2、3枚时,阳性鸡检出比例分别为2.5%、5.0%和6.0%,随着检测鸡蛋数的增加,检出阳性鸡的比例也逐渐增加,检测的准确性也逐渐增加;对慢羽系种蛋3个批次检测时,3批都检出阳性鸡的比例为7.5%,2批检出率为21.4%,1批检出率为39.3%,31.8%的慢羽系在3批中都呈阴性。雏鸡胎粪检测结果显示:慢羽系个体阳性率(5.2%)高于快羽系(1.45%),慢羽系家系后代阳性率(32.0%)高于快羽系(10.9%);当1个家系某批次中检出阳性雏鸡数≥3只时,93.4%的家系会在多批纯繁中都会检出阳性雏鸡。本试验证明了ALV感染鸡只的排毒呈现明显的间歇性,需要多次反复检测才能达到种群净化的目的。     

禽成髓性白血病病毒p27和gag基因的克隆

禽成髓性白血病是由禽成髓性白血病病毒引起的一种禽白血病（Avian Leukosis)。禽成髓性白血病病毒的gag基因具有高度保守性，其编码的群特异性抗原p27是禽白血病病毒所共有的主要核心蛋白，可做为禽白血病的诊断抗原。本实验采用AMV感染鸡胚成纤维细胞（CEF），提取感染细胞总RNA，用随机引物反转录成cDNA，根据已经发表的AMV BAI－A株序列设计两对针对p27基因和gag基因的特异性引物，分别进行PCR，成功地扩出p27基因和gag基因，其片段分别为793bp和2．1Kb。以gag基因的PCR产物为模板，采用p27的特异性引物也成功扩出p27片段。分别将p27,gag基因与pGEM－TEasy载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。对含有p27基因的质粒进行测序，结果证明成功克隆了p27基因，间接证明了2．1Kb的片段是gag基因。p27和gag基因的成功克隆为该病的探针诊断和gag基因的表达提供了基础。     

不同类型鸡泄殖腔棉拭子禽白血病病毒p27抗原检测与病毒分离的相关性分析

为探讨泄殖腔棉拭子或种蛋中禽白血病病毒(ALV)-p27抗原检测与病毒分离检测之间的相关性,对不同类型鸡编号后分别对应采集泄殖腔棉拭子或蛋清后以ALV-p27抗原检测试剂盒检测,同时无菌采集抗凝血接种DF-1细胞进行ALV的分离鉴定。结果显示,人工感染A亚群ALV的SPF鸡群泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测与病毒分离有很高的吻合率,相对于病毒分离法,119次泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测中出现有1例假阳性和3例假阴性;从美国进口的200只祖代肉鸡3次采血DF1细胞分离病毒结果均为阴性,而泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原阳性率依次为4.00%(8/200),2.97%(5/168)和2.61%(4/153),假阳性率为3.30%。相对于病毒分离法,正在实施ALV净化的不同遗传背景地方品系鸡泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测的假阳性率高达93.20%~100.00%,还有一定比例假阴性(1/9,1/4,1/3)。本研究大量对应比较的数据表明,相对于血浆病毒分离法,不同类型鸡的泄殖腔棉拭子ALVp27抗原检测法不仅有很高的假阳性率,还有一定比例的漏检率。在种鸡场的ALV净化过程中考虑到成本,不建议以泄殖腔棉拭子作为检测材料。本试验为我国鸡群禽白血病净化检测和临床鉴别诊断提供参考依据。     

禽白血病/肉瘤病毒群特异性抗原p27的分离纯化及其抗体的制备

采用细胞培养法增殖禽白血病/肉瘤病毒(ALV/RSV)A亚型,然后对其进行超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化病毒,再采用电泳分离与电洗脱收集相结合的方法纯化p27蛋白.经检测,提取的p27蛋白具有良好的抗原性与免疫原性.用该蛋白免疫家兔制备的兔抗p27抗体,经ELISA方法检测其效价可达1:6400以上.     

禽白血病病毒自然感染及抗体变化动态规律

试验随机选取1日龄地方鸡(原种鸡)115只,带翅号。于1、7、14、21、28、38、58、68、88、98、108、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、260、300日龄按号对应采泄殖腔棉拭子进行ELISA检测禽白血病病毒p27抗原。同时按号对应翅静脉采血分离血清进行ELISA检测A、B亚型抗体和J亚型抗体。260日龄时,对全群鸡只进行病毒分离。试验结果表明,全群鸡在监测的300日龄内均有ALV感染发生。其中p27抗原检出率在7日龄时达到最低值,为2.11%;在170日龄时达到最高峰,为32.18%。从38日龄到300日龄逐渐出现ALVA、B抗体阳性鸡只,阳性率在10%左右。260日龄时阳性率达到最高峰,为30.86%。260日龄病毒分离阳性率为29.49%(23/78),略高于棉拭子p27检出率20%(16/80),二者符合率为79.49%。J亚群抗体检测均为阴性。病毒感染与抗体变化没有直接相关性。     

SPF鸡感染J亚群禽白血病病毒血清抗体与卵黄抗体的变化动态及其相关性

为研究以卵黄抗体替代血清抗体判定SPF鸡群J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染状态的可行性,人工接种ALV-J的SPF鸡23周龄时,分别从25只抗体阳性鸡及22只抗体阴性鸡采集血清和卵黄,比较不同稀释度的卵黄与血清中ALV-J抗体的阴阳性吻合率及ELISA检测S/P值相关系数。结果表明,相对于血清抗体,将卵黄1∶400稀释,假阳性和假阴性最少,确定1∶400为卵黄最适稀释度。对40只攻毒SPF鸡和36只同批次单独饲养的空白SPF鸡在25~34周龄,每隔3周采集一次血清,每周采集一次种蛋,共采集304份血清样品和760份卵黄样品。血清按1∶500稀释,卵黄按1∶400稀释,所有血清和卵黄抗体用美国IDEXX公司ALV-J抗体ELISA检测试剂盒检测,同一只鸡同一时段采集的血清和卵黄样品严格在同一次ELISA中检测。结果显示,在25~34周龄,卵黄抗体检测判定结果与血清整体吻合率为82.5%~95%。上述结果表明用卵黄抗体替代血清样品检测来监控SPF鸡群对ALV-J的感染状态是可行的,疫苗生产企业可通过抽检SPF鸡场提供SPF种蛋的卵黄抗体水平来判断SPF鸡场的洁净度。     

青海省禽白血病血清抗体的检测

禽白血病(avian leukosis)又名大肝病、肝淋巴瘤病、鸡骨质石化病、大理石骨病、粗腿病等，是由禽白血病一肉瘤病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。临床以产蛋下降和死亡增加为特征。本病在世界各地均有发生，大多数鸡群均可感染。青海省禽白血病感染情况以     

禽白血病病毒群特异性抗原单克隆抗体的制备与鉴定

为制备禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原的单克隆抗体(MAb),本研究从ALV-J病毒株感染DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出ALV群特异性抗原p27基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,酶切鉴定后进行序列测定和分析。最后将p27基因亚克隆至载体pET-30a(+)中,转化受体菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测获得融合蛋白。经过western blot检测,表达的蛋白具有良好的反应原性。将纯化的p27蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得5株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株。5株MAb与纯化的p27蛋白以及不同亚群ALV可以发生特异性反应。所制备的MAb为禽白血病的诊断方法研究奠定了基础。     

种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与鸡群禽白血病发病率的相关性研究

本研究旨在观察种鸡群所产种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与种鸡群发病状况及其下一代鸡群禽白血病发病率的相关性,为鸡群净化和禽白血病预警提供参考依据.对国内海兰褐蛋鸡等品系不同祖代及父母代共7个种鸡场所产种蛋的P27抗原进行了检测,对部分种鸡场的ALV-A/B和ALV-J抗体进行了检测和病毒的分离鉴定,对各种鸡群孵化后下一代鸡群的禽白血病发病状况和客户投诉情况进行了追踪调查.7个种鸡场所产种蛋中P27抗原检出率为0%～12％,P27抗原检出率与种鸡群的发病状况及其子代鸡群的发病状况和客户投诉情况密切相关,即种蛋中P27抗原检出率越高,种鸡群发病情况越严重,下游客户鸡群发病率和投诉率越高.种鸡群的种蛋P27检出率与种鸡群及其孵化后鸡群的禽白血病感染状况具有较好的吻合性,可以作为开展ALV的流行病学调查和禽白血病感染风险评估的重要指标.     

间接ELISA检测抗禽白血病病毒抗体方法的建立

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是禽白血病的病原,可引起鸡的免疫抑制和肿瘤。净化种鸡群是控制ALV的主要方法之一。本研究将ALV的p27基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌中获得了高效表达,以纯化后的p27-GST融合蛋白为抗原包被,经过条件优化,建立了检测鸡血清中抗ALV抗体的间接ELISA方法。与IFA检测结果比较,该方法比IDEXX ELISA试剂盒有更高的符合率。可用于禽白血病病毒感染根除的大规模检测,并具有低成本、易操作的特点,能同时检测到针对ALV所有亚群的抗体。     

禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白P27基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

从人工感染禽白血病劳斯肉瘤病毒的SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中提取RNA,通过RT-PCR方法扩增出720bp的gag P27基因片段,克隆至pMD18-T载体,酶切鉴定后进行序列测定和分析,表明该片段编码序列与国外RSV分离株(JO2342)的同源性达97.3%.将该片段亚克隆至pGEX-6 P-1原核表达载体,转化受体菌BL-21,经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明目的基因得到高效表达,所表达蛋白是大小为56kD的融合蛋白,占菌体总蛋白的23%.表达产物经Glutathion Spharose4 B树脂亲和层析法纯化后,每100 mL菌液最终可获得5 mg重组t27蛋白,蛋白纯度在90%以上.用兔抗自然P27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组P27蛋白有抗原反应活性.用纯化的重组P27蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应.所制备的重组P27蛋白和多克隆抗体将为禽白血病的诊断及ELISA试剂盒的研制奠定基础.