规模猪场PRRSV的净化

本文就某三点式布局的现代集约化猪场,在爆发PRRS后,利用对PRRSV的最新研究成果,结合国外的成功经验,因地制宜地制订了PRRSV清除程序。通过猪场的部分清群和全场清洗消毒,以较小的代价,成功地清除了PRRSV,为我国规模猪场的PRRS控制和净化,提供了宝贵的经验。     

猪群口腔液与血液中PRRSV和PCV2感染的病原和抗体消长规律调查

从浙江某规模猪场分别采集不同日龄商品猪口腔液与血清样本,应用实时定量PCR和ELISA方法,分别检测2种体液中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的抗原和抗体水平,并分析其消长规律。结果提示:2种病毒各自的特异性抗体在口腔液和血清中的消长规律基本一致。相比血清,口腔液中的母源抗体存续时间更长(3周),主动免疫后产生特异性抗体的时间则更晚(3周)。口腔液中PRRSV和PCV2的感染动态规律,与血清和口腔液抗体的消长规律也具有很好的相关性,在出现病毒感染高峰后,血清和口腔液特异性抗体转阳,其中血清抗体的转阳反应更为迅速(3周)。本研究为进一步发展猪群口腔液检测系统提供了临床依据。     

青海省部分地区调入仔猪PRRSV抗体ELISA检测

采用ELISA方法对外省调入青海省西宁、湟中、湟源、互助、乐都、循化和民和等七个地区的449份仔猪血清进行PRRSV抗体ELISA检测，结果显示被检血清免疫抗体阳性率为2．5％，感染抗体阳性率为8．9％。其中原产地为甘肃、四川、江苏、重庆的仔猪分别占总体猪的87．3％、5．4％、5．1％、2．2％，其血清的PRRSV免疫抗体阳性率分别为1．3％、0％、0％、60％，感染抗体阳性率分别为9．2％、0％、17．4％、0％，表明外省调入青海省的仔猪RRRS的总体免疫状况不是很好，感染情况较为严重，对此病的检疫防控力度还需进一步加强。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株人工单独感染3头3周龄仔猪，并用PRRSV ATCC VR-2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2头3周龄仔猪，每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现，并用HerdChek IDExx试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀，PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀，对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM)．用PAM进行抹片，同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明，用所获得的3株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外，用IIF检测7头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片。其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应；对这2头猪的肺组织进行病毒分离。在盲传到第4代时Marc-145细胞上产生明显的细胞病变，进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠，且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

规模化猪场PRRSV的净化

本文就某三点式布局的现代集约化猪场，在爆发PRRS后，如何利用对PRRSV最新的研究成果．结合国外的成功经验，因地制宜地制订了PRRSV清除程序。通过猪场的部分清群，和全场清洗消毒，以较小的代价，成功地清除了PRRSV，为我国规模猪场的PRRS控制和净化，提供了宝贵的经验。     

2013年广东省湛江市规模化猪场PRRSV免疫抗体的监测结果

为了解广东省湛江市规模化猪场中猪繁殖与呼吸综合征的防控状况,2013年对广东省湛江市8个规模化猪场进行猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫抗体的监测。共采集样品血清802份,采用ELISA的方法进行检测。结果显示,2013年4月、8月和12月猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫抗体的合格率分别为88.85%、79.48%和81.75%,抗体离散度分别是39.70%、49.60%和67.95%;全年免疫抗体合格率为83.29%。可见2013年广东省湛江市规模化猪场中猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫抗体合格率虽高,但疫苗免疫效果不理想,防控形势比较严峻。     

PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定

为制备只包含抗体可变区片段(Fv)的MAb2-5G2单链抗体(scFv),本研究从分泌MAb2-5G2的杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录制备cDNA作为模板扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因.以VH-1inker-VL的形式通过重叠PCR制备scFv基因,构建重组表达质粒pEasy-scFv,并在大肠杆菌中获得正确表达.通过western blot和间接免疫荧光鉴定表明scFv蛋白能够被兔抗MAb2-5G2的抗体(Ab3)识别,复性后的scFv蛋白能够特异性结合Marc-145细胞.该研究结果为进一步明确MAb2-5G2结合Marc-145细胞功能区域奠定了物质基础.     

规模化猪场PRRSV抗体水平监测与分析

为掌握江苏泰州周边地区PRRSV在猪群中的感染情况,应用ELISA方法对规模化猪场的445份血清样本进行猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)抗体水平检测,结果显示不同阶段的猪群PRRSV抗体水平,其中仔猪PRRSV抗体阳性率最低,为34.1%,育肥猪群PRRSV抗体水平其次,母猪群PRRSV抗体阳性率最高,为63.5%,平均阳性率为48.3%。对10个不同猪场进行PRRSV抗体水平检测,结果显示血清抗体平均阳性率为55.87%,此结果为当地PRRSV的综合防治提供参考依据。     

特异性中和抗体终止猪体内猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲型标准株（VR-2332）的ORF6及ORF7部分保守序列，设计合成1对特异引物，通过优化RT—PCR反应条件，建立了从血清中检测PRRSV RNA的RT—PCR诊断方法。60日龄仔猪经鼻腔接种1mL 10^5.6TCID50/／mL PRRSV强毒液，7d后肌肉注射中和效价为1：64的特异性高免血清，每隔1周利用RT—PCR检测猪体内PRRSVRNA，5周内PRRSV RNA检测均为阴性，表明高滴度特异性中和抗体完全终止了PRRSV感染猪体内的病毒复制。     

用ELISA方法检测猪血清中PRRSV抗体

应用ELISA方法对信阳市10县区86个规模养殖场未进行PRRSV免疫接种的1 329份血清进行PRRSV抗体检测。结果显示,平均阳性率为49.5%,其中阳性率最高县区为65.9%。阳性率最低县区为27.8%;长白猪感染率最高为56.3%,本地淮南猪感染率最低为30%;小规模猪场感染率较高,大规模猪场感染较低。不同年龄段猪的感染率差异不大。     

PRRSV抗体竞争ELISA检测方法的建立与标准化研究

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因的原核表达产物重组N蛋白为包被抗原,利用兔抗重组N蛋白血清和PRRS猪血清竞争该抗原,建立间接竞争ELISA方法检测PRRS抗体。经研究确定重组N蛋白的包被浓度为0·3μg/mL,检测血清不用稀释,兔抗重组N蛋白血清的工作浓度为1∶3000,酶标抗体的工作浓度为1∶10000,包被液为0·05mol/L、pH9·6的碳酸盐缓冲液。该方法特异性强,稳定性和重复性好,整个检测过程可在3h内完成。以IDEXX试剂盒的检测结果为参照标准,该方法的敏感性为79·76%,特异性为90·9%,符合率为83·59%。将该方法按试剂盒要求标准化,4℃放置5个月,检测效果不变。     

广东地区小型猪场PRRSV血清抗体水平调查和分析

在广东省8个地区的40个猪场采集血样,进行了PRRSV血清抗体水平调查,结果表明,受检的714份血清中,523份为PRRSV抗体阳性,总体阳性率为73.25%,其中佛山、河源、清远、江门、茂名送检的样本PRRSV抗体阳性率均在70%以上,合格率高于农业部规定的70%;但湛江、肇庆、惠州送检的样本PRRSV抗体阳性率在70%以下,在这些地区猪场群体免疫不合格。     

用重组核衣壳蛋白ELISA检测PRRSV抗体的研究

ＰＲＲＳＶ重组Ｎ蛋白ＥＬＩＳＡ检测人工感染猪血清７５份,与ＩＤＥＸＸ公司ＥＬＩＳＡ试剂盒及ＩＦＡ的符合率分别为９７．３％和１００％。检测疫苗免疫猪血清,阳性率１００％。在免疫后６ｄ就能检出抗体,比ＩＦＡ敏感。检测８５份我国田间猪血清,阳性率１８．８％。     

不同特性IgG促进PRRSV在PAM细胞中的增值作用

本试验通过研究IgG对猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)增殖情况的影响,来探讨抗PRRSV特异性和PRRS非特异性抗体在PRRSV-ADE中的作用。分别将抗PRRS特异性IgG(2.64g/L)和非特异性IgG(2.63g/L)作倍比稀释,与等体积含200TCID50/100μL的PRRSV Hn-1/06株病毒液混合,制备成一系列的感染性免疫复合物(PRRSVIgG)和阴性抗体-病毒混合液(PRRSV+IgG),接种PAM细胞;同时将纯化的猪阴性IgG(2.63g/L)和兔抗猪IgG(2.64g/L l)等体积混合制备免疫复合物(IC),分别与等体积含200TCID50/100μL的PRRSV Hn-1/06株病毒液混合,制备成免疫复合物-病毒混合液(PRRSV+IC),接种PAM细胞。接种24h后,用实时荧光定量PCR方法检测PRRSV的mRNA水平。同样的方法,分别将2倍稀释的PRRSV-IgG,PRRSV+IgG和4倍稀释的PRRSV+IC接种PAM细胞,用实时荧光定量PCR方法分别检测感染12、24、36和48h后不同时间段内PRRSV的mRNA水平。结果显示,一定质量浓度的PRRS特异性亚中和水平抗体和非特异性抗体,在感染48h内均能极显著促进PRRSV在PAM细胞中增殖;而适当剂量的免疫复合物,在感染48h内也均能促进PRRSV在PAM细胞中增殖。结果表明,一定质量浓度的PRRS特异性亚中和水平抗体和非特异性抗体均能促进PRRSV在PAM细胞中增殖,但是不同特性的抗体对PRRSV的增殖能力存在着差异。     

北疆规模化猪场CSFV、PRRSV、PRV血清抗体水平监测及分析

为了解北疆地区规模化猪场猪瘟,蓝耳,伪狂犬gE抗体水平,本研究选取3个规模化种猪场,共采集296份血清,采用ELISA抗体检测方法,对其进行猪瘟,蓝耳,伪狂犬gE血清抗体检测工作.结果显示,育肥猪猪瘟抗体阳性率为64.40％ ～100.00％,蓝耳病抗体阳性率为72.00％ ～98.33％,伪狂犬gE抗体阳性率为23....     

上海地区野鸟和家禽中PRRSV抗体的血清学调查

2005年3～5月，采用ELISA法对来自于上海地区的208份野鸟和357份家禽的血清样品进行了猪繁殖和呼吸综合征病毒（porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）抗体的血清学调查。结果表明，受检的5种家禽存有不同程度的抗体阳性率，而野鸟的阳性样品集中于绿头鸭和麻雀。     

PRRSV重组N蛋白的抗原性分析及其特异性抗体制备

利用大肠杆菌表达技术和亲和层析法纯化出重组PRRSV N蛋白 ,用间接ELISA法和Western blot分析 ,证明其具有较好的抗原性。将该纯化蛋白采用大剂量长程免疫法免疫家兔 ,制备了兔抗重组N蛋白抗体 ,用Western blot分析和竞争抑制试验证明其具有很高的特异性 ,ELISA效价达 1∶32 0 0以上。     

2018-2020年云南省边境地区猪群PRRSV抗体检测与分析

为了解和对比云南边境地区和其他地区2018-2020年猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)免疫保护水平，疫情发生风险，2018-2020年在云南与缅甸、老挝、越南接壤的14个边境县和其他地区的规模场、散养户采集猪血清，应用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ELISA抗体检测方法进行病毒抗体检测。检测结果显示：2900份猪血清样品中，阳性样品2179份，群体阳性率为75.14%(2179/2900),S/P平均值为1.0510±0.7484,变异系数为70.77%。各县PRRSV抗体阳性率在50%～90%之间，并且不同地区存在差异。抗体阳性率最高为孟连91.33%(274/300)。不同阶段猪群PRRSV平均抗体水平存在差异，哺乳仔猪抗体阳性率最低为48.14%(297/617),育肥猪抗体阳性率最高87.30%(949/1087)。入境猪群和境内猪群抗体阳性率差异显著(P<0.01),养殖场，屠宰场，交易市场猪群PRRSV抗体阳性率要高于自然散养户。本研究结果表明：猪群PRRSV抗体水平在云南边境地区整齐度不高，且地区间存在差异，入境猪群有传播疫情的风险，因此可依据边境地区的养殖特点...     

检测PRRSV—Ⅰ、PRRSV—Ⅱ和PCV-2多重PCR方法的建立及初步应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virns,PRRSV）欧洲株（PRRSV-Ⅰ）、北关株（PRRSV-Ⅱ）常与猪圆环病毒2型（Porcine Circorirnstype 2,PCV-2）呈混合感染,严重影响养猪业的经济效益。本文根据GenBank上已发表的PRRSV北美型（PRRSV-Ⅰ）、PRRSV欧洲型（PRRSV-Ⅱ）、圆环病毒2型（PCV-2）的基因组全序列,分别设计了3对能特异性扩增PRRSV-Ⅰ、PRRSV-Ⅱ和PCV-2的引物,建立并优化了可同时检测PRRSV-Ⅰ、PRRSV-Ⅱ和PCV-2三种病毒的多重PCR方法,通过对临床病料的检测,证实了此方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点,适合大量样本的分析与鉴定。利用该方法能在24h内对样品进行检测并获得结果,因此本方法的建立对这3种病毒的早期快速诊断有十分重要的意义。     

猪PRRSV受体唾液酸黏附素多克隆抗体的制备

唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)是猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的主要受体,研究该受体在PRRSV感染过程中的作用依赖于特异的抗体.为制备Sn的抗体,首先依据通过DNAstar软件分析的抗原指数,确定编码114个氨基酸的Sn抗原表位基因(Sn114),然后依据大肠杆菌偏爱的密码子对该基因进行密码子优化,并由人工合成该基因.将合成的基因克隆到pET-32a(+)质粒中构建成与硫氧还蛋白(Trx)和6×His融合的Sn114基因原核表达载体,将表达载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,在IPTG的诱导下使其表达.利用Ni NTA琼脂糖分离纯化表达的Sn114融合蛋白,再用Sn114融合蛋白免疫家兔,通过ELISA方法检测免疫后家兔血清的抗体滴度,并通过Western blot和细胞结合试验检测抗体的特异性.结果表明,本试验构建的Sn114表达载体能够介导Sn114融合基因在大肠杆菌中进行高效表达,表达量为63 mg/L;用纯化后的Sn114蛋白免疫家兔,免疫后34 d抗体滴度为1∶10 240.抗体特异性检测结果表明,所制备的Sn抗体能与猪肺泡巨噬细胞的Sn抗原进行特异性免疫反应.