西瓜枯萎病菌镰刀菌酸对西瓜苗作用机制的初步探讨

 镰刀菌酸是由镰刀菌属中那些能引起多种植物萎蔫的病原菌所产生的一种非特异性毒素,从发现至今已有60多年了,但关于它在病程中作用问题的研究还不多,而且意见也不一致。     

主要环境及营养因素对西瓜枯萎病菌生长的影响

采用菌丝生长速率法和产孢量测定研究了不同温度、光照、pH及碳氮源对来源于海南、河北和上海的3株西瓜枯萎病菌Fo-HN-46、Fo-HB-12和Fo-SH-1生长速率和产孢量的影响。结果表明:西瓜枯萎病菌菌株的适宜生长温度为20~30℃,Fo-HN-46最适生长温度为28℃,Fo-HB-12和Fo-SH-1最适生长温度为25℃,产孢的最适温度为28~30℃;光照对西瓜枯萎病菌生长速率无显著影响,对产孢影响显著,Fo-HN-46在黑暗条件下单位面积产孢量最高,Fo-HB-12和Fo-SH-1在半光照条件下产孢量最高;pH对西瓜枯萎病菌菌株的生长速率和产孢量有显著影响,pH 7~9时菌丝生长速率快,pH 8~11时产孢量高;葡萄糖、淀粉和乳糖作为碳源能够显著增加西瓜枯萎病菌的产孢量;蛋白胨作为氮源能显著促进菌丝生长,硝酸钠、酵母粉和蛋白胨均能显著增加西瓜枯萎病菌的产孢量。用最适碳源、氮源培养,Fo-HN-46生长速率大于Fo-HB-12和Fo-SH-1。Fo-SH-1产孢量高于Fo-HN-46和Fo-HB-12。     

培养条件对西瓜枯萎病菌镰刀菌酸产生的影响

 尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fusarium oxysporum Sch l.f.sp.niveum(E.F.Smith) Snyder et Hansen]菌株在4种培养基(理查德培养基,Armstrong镰刀菌培养基,MS无机盐+蔗糖培养基,PDB培养液)中均能产生镰刀菌酸(Fusaric acid),理查德培养基中镰刀菌酸最高时的浓度是其它3种培养基的6~22倍。理查德培养基以C/N为5:1,葡萄糖为C源,NO-3为N源的营养条件较有利于镰刀菌酸产生。培养基初始pH值为4,通气和连续光照的培养条件最有利于菌株产生镰刀菌酸,烟酸的加入可终止镰刀菌酸产生。各培养基中孢子浓度与镰刀菌酸浓度之间呈负相关的变化趋势,培养基的pH值呈趋中(pH6~8)变化,与镰刀菌酸产生无相关性。在理查德培养基中,菌丝生长与镰刀菌酸产生之间存在平行关系。     

西瓜枯萎病菌侵染西瓜根茎部的组织病理学观察

为探明西瓜枯萎病菌侵染西瓜根系及茎的过程,本研究选取一株致病力较强的西瓜枯萎病菌FO1022,利用绿色荧光蛋白基因（GFP）标记该菌株,观察病原菌侵染西瓜根茎部的组织学过程。结果表明,用GFP标记的病菌接种感病西瓜品种‘苏蜜1号’,接种后2 d,显微观察显示病原菌的分生孢子附着于西瓜根系表皮细胞并萌发,沿细胞间层定殖生长;接种后5 d,在西瓜根部维管束导管中观察到大量菌丝和大型分生孢子,在根部表皮细胞上观察到大量厚垣孢子,在茎部部分维管束导管中也观察到少量的菌丝,此时48.6%的幼苗表现萎蔫症状;接种后9 d,茎部所有维管束导管都充斥着密集的菌丝体,此时91.7%的幼苗表现枯萎和死亡。与侵染感病品种相比,该菌株在侵染中抗品种和高抗品种时,在侵染时间上要明显滞后。本研究从组织病理学的角度观察并分析了GFP标记的西瓜枯萎病菌侵染西瓜根茎部的过程,为研究西瓜枯萎病菌的致病机理提供参考。     

农杆菌介导的西瓜枯萎病菌遗传转化

为获得带GFP标记的西瓜枯萎病菌转化株,用于后期观察病原菌侵染过程,采用农杆菌介导的方法,对西瓜枯萎病菌1号生理小种进行了遗传转化。结果表明:共培养时间为36h,枯萎病菌孢子和农杆菌AGL1比例为1∶1时该菌株的遗传转化效率最高,可以达到117.33个转化子/107个孢子。转化株的孢子、菌丝体及萌发的孢子均能发出稳定而强的绿色荧光。转化株的致病力检测显示其致病力与转化前的野生菌株致病力无明显差异。结果表明本研究获得的带GFP标记的西瓜枯萎病菌转化株可用于观察病菌在西瓜根系的侵染过程。     

西瓜枯萎病菌遗传多样性的相关序列扩增多态性分析

对30个西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.niveum菌株基因组DNA进行相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记分析,以探究其遗传多样性与地理来源的关系。采用尖孢镰刀菌西瓜专化型Fusarium oxysporumf.sp.niveum0、1、2号生理小种的基因组DNA为模板,对225对SRAP引物进行筛选,筛选出20对多态性、重复性较好且条带清晰的引物,对30个菌株进行PCR扩增,共扩增出386条带,其中多态性条带有371条,多态性比率为96.11%,平均每对引物扩增出19.3个位点和18.55个多态性位点。UPGMA法聚类分析结果显示,供试菌株两两之间的遗传相似系数范围为0.69~0.90,平均为0.79,说明尖孢镰刀菌西瓜专化型的遗传多样性较为丰富。基于SRAP标记聚类分析表明,30个菌株在遗传相似系数为0.70处被划分为3个类群,I类群包含24个菌株,其中18个来自湖南省,Ⅱ类群只包含1个来自黑龙江省哈尔滨市的菌株,它和另一个来自黑龙江地区的菌株被划分到不同的类群,且遗传距离相对较远;Ⅲ类群包含了5个菌株,其中3个来自海南三亚,其余两个来自湖南省。根据菌株的分布情况来看,菌株的聚集与地理来源没有明显的相关性。     

山东西瓜枯萎病菌致病性分化及品种抗性的初步研究

1989—1991年在自然病圃中观察了25个西瓜品种对西瓜枯萎病的抗病性。结果表明,国内只中8602F₁,是唯一保持高抗,中8601F₁,新澄1号和中育号等表现出中度抗性外,其他均属轻抗或感病;而来自国外的抗性品种显示出与原来一致的或更高的抗性。根据在国外鉴别寄主上的反应,致病性可分为2个不同的类型,类型Ⅰ占总分离物的74.4％,致病力中等;类型Ⅱ致病力较强,但仅分布于少数老瓜区。     

芽孢杆菌B11拮抗蛋白性质及其对西瓜枯萎病菌的作用机理

芽孢杆菌(Bacillus sp．)B11分离自土壤，其拮抗蛋白粗提液在温度60、80℃各处理30min后仍能保持抗菌活性，对紫外线、蛋白酶K、RNase处理稳定，对胃蛋白酶、胰蛋白酶、氯仿部分敏感，作用活性pH(pH4～10)范围较宽。B11拮抗蛋白对西瓜枯萎病菌具有较强的拮抗作用，其抑菌机制主要使病菌菌丝畸形，细胞质浓缩，孢子不萌发或萌发异常。     

采用西瓜汁蔗糖琼脂培养基有效筛选西瓜枯萎病菌拮抗细菌

 在从摩洛哥引进的脐血橙田间植株的新梢嫩叶上观察到褪绿环斑和污斑,褪绿斑驳,叶背有边缘凹刻的圆形或近圆形环,以及脉明和叶脉环阻等症状。通过向Madam Vinous甜橙、邓肯葡萄柚等柑桔类指示植物的嫁接接种;用钝刀醮取汁液切割指示植物墨西哥来檬和埃特洛香的茎部进行机械传播;以及汁液磨擦接种草本指示植物昆诺藜等方法,鉴定到柑桔环斑病毒(citrus ringspot virus,CRSV)。嫁接接种的柑桔类指示植物上的症状包括新梢休克、新叶脱落,新叶表现褪绿环斑和污斑以及斑驳,脉明和叶脉环阻等;机械接种的柑桔类指示植物表现新叶的褪绿环斑症状;昆诺藜在接种后4~6d于接种叶上产生褪绿至坏死的局部枯斑,但无系统感染的症状出现。取表现症状的柑桔类指示植物和昆诺藜的叶片作接种源,汁液磨擦接种回接至昆诺藜,再现了同样的症状。     

AM真菌和镰刀菌对西瓜根系膜脂过氧化作用和膜透性的影响

 在温室盆栽条件下研究了丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌Glomus versiforme (Karsten) Berch和西瓜枯萎镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)对西瓜根系中膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量和细胞膜透性的影响。结果表明,接种AM真菌的西瓜根系中MDA含量、组织自动氧化速率和膜透性均低于对照,先接种G. versiforme,后接种F. oxysporum f. sp. niveum处理的MDA含量、组织自动氧化速率和细胞膜透性均低于只接种F. oxysporum f. sp. niveum的处理。接种G. versiforme感枯萎病西瓜品种"郑杂5号"MDA含量、组织自动氧化速率和膜透性降低幅度大于抗病品种"京欣1号"的接种处理,说明G. versiforme可降低感病西瓜品种的膜透性和MDA的产生,从而有效地保护细胞膜系统,减轻F. oxysporum f. sp. niveum对西瓜的为害程度。     

西瓜种传镰刀菌形态和分子鉴定及其对种子发芽的影响

 采用洗涤检验法和PDA培养基法,从京欣一号和新京欣一号西瓜种子的种壳上分离得到镰刀菌,通过形态学观察和分子检测进行了鉴定,并研究了其对种子发芽的影响。通过菌落形态、色素颜色、菌落生长速率、大型分生孢子、小型分生孢子、厚垣孢子以及分生孢子梗等形态学观察,初步认为其为尖孢镰刀菌;采用真菌rDNA ITS区的通用引物、镰刀菌属特异性引物和尖孢镰刀菌特异性引物对其DNA进行PCR扩增,PCR产物经连接转化并验证后测序,将测序结果登录GenBank进行BLAST分析,分子检测结果与形态学观察结果一致,表明西瓜种子种壳携带的镰刀菌为尖孢镰刀菌,此结果为国内首次报道。用种传尖孢镰刀菌孢子悬浮液处理西瓜种子后,发芽势、发芽率和发芽指数均显著降低。     

西瓜枯萎菌拮抗细菌的筛选、鉴定及防效测定

从内蒙古、新疆、安徽、河南、江苏、江西6省的西瓜、黄瓜和茄子3种作物根际土壤和病健组织中,共获得样本64份,分离得到细菌1050株。室内抑菌活性测定结果表明：9株细菌分离物对西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum、甘蓝黑斑病菌Alternaria brassicicola、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici和番茄灰霉病菌Botrytis cinerea均具有很强的拮抗作用,其中菌株NBT-15和PL-82对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用比较明显,抑制率分别为60.5%和55.3%。盆栽防病试验结果表明：NBT-15和PL-82对西瓜枯萎病的防治效果分别为80.4%和75.6%。形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果确定菌株NBT-15为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,PL-82为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。     

福建省香蕉枯萎病菌硝酸盐营养突变体的营养体亲和性测定

 Fourteen strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense were induced to produce 146 nitrate-nonutilizing(nit) mutants on a chlorate-containing medium. Among them, there were 117 nit1 mutants(80.14%), 17 nit3 mutants(11.64%) and 12 nitM mutants(8.22%). These strains were divided into two vegetative compatibility groups(VCGs) by the vegetative compatibility tests. Twelve strains of F. oxysporum f. sp. cubense from Musa AAA belonged to VCG1, two trains from Musa ABB belonged to VCG2.     

黄瓜枯萎病菌毒力、营养体亲和性及ISSR分析

 本研究对来自哈尔滨、长春、沈阳、北京、西宁5个城市的70个尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌株进行了毒力、营养体亲和性及ISSR分析。毒力测定结果显示黄瓜枯萎病菌在东农803品种上存在明显的毒力分化。在营养体亲和群的测定中有8个菌株没有产生nit突变体,2个菌株经测定为异核体自身不亲和性菌株,不能进行营养体亲和群的测定;其余60个菌株可分为5个营养体亲和群。利用筛选的7个引物对70个菌株进行了ISSR分子标记,聚类分析可将70个菌株分为3个类群,其中IGⅠ的41个菌株均来自东北三省,IGⅡ的21个菌株均来自北京,IGⅢ的8个菌株全部来自西宁。VCGs和ISSRs与菌株的地理来源及毒力存在一定的相关性。     

Occurrence of Fusarium oxysporum f. sp. melonis Race 1 in Japan

In 1994, Fusarium wilt of melon cultivars which are resistant to races 0 and 2 of Fusarium oxysporum f. sp. melonis was observed in southern area of the Lake Biwa region, Shiga prefecture. In commercial fields, mature plants of cv. Amus which were grafted onto cv. Enken Daigi 2, and of cv. FR Amus showed yellowing, wilting and finally death before harvesting of fruits. Diseased plants had vascular and root discolorations, and their stem sections yielded typical colonies of F. oxysporum. When the Shiga strains were tested for their pathogenicity to 12 species of cucurbits, they caused wilts only on melon. Using race differential cultivars of melon, the Shiga strains were classified as race 1 of F. oxysporum f. sp. melonis, which has not been reported in Japan. To further characterize their pathogenicity, the strains were used to inoculate 46 additional cultivars of melon, oriental melon and oriental pickling melon. All the race 1 strains were pathogenic to the cultivars tested, and their host range was apparently different from those of strains belonging to other races (races 0, 2 and 1,2y). DNA fingerprinting with a repetitive DNA sequence, FOLR3, differentiated race 1 strains from strains of races 0 and 2, but not from race 1,2y strains. Received 2 July 1999/ Accepted in revised form 30 September 1999     

瓜黑星病菌、枯萎病菌和蔓枯病菌的三重PCR检测

通过测定黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)rDNA的ITS序列,比对近缘种及瓜类几种重要病原菌的ITS序列,设计出特异性引物HX-1/HX-2,经过对引物HX-1/HX-2PCR条件的优化,可以扩增出1条190bp的黄瓜黑星病菌特异性DNA条带,灵敏度达到1pg/μL。进一步将引物HX-1/HX-2和瓜类枯萎病菌、瓜类蔓枯病菌特异检测引物Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组合,建立三重PCR体系,可一次检测出瓜类黑星病菌、瓜类枯萎病菌、瓜类蔓枯病菌3种瓜类植物重要的病原菌。建立了可以应用于田间瓜类黑星病菌PCR检测技术和瓜类主要病害三重PCR检测技术,对瓜类病害的诊断和防治具有重要的指导作用。     

甘蓝枯萎病菌REMI转化体系的建立

建立高效、稳定的甘蓝枯萎病菌REMI转化体系,为进一步获得特定表型突变体及基因功能研究建立技术储备.利用REMI(restriction enzyme mediate intergration)转化方法,将线性化的含有潮霉素抗性基因的pUCAT-PH质粒转化甘蓝枯萎病菌A6菌株的原生质体,摸索获得转化子最适的潮霉素筛选浓度以及不同限制性内切酶和酶量对转化效率的影响;利用PCR(polymerase chain reaction)技术对潮霉素抗性转化子进行验证.结果表明转化子的最适潮霉素筛选浓度为50 μg/mL;转化效率较高的限制性内切酶为HindⅢ,并且转化效率最高时的酶量为20 U.利用该转化体系构建了含1 050个转化子的甘蓝枯萎病菌转化子库,对转化子进行Southern验证,证明该转化体系是可行的.     

香蕉枯萎病菌生理分化研究摘要本研究

本研究对香蕉枯萎病菌菌株FOCAAA9(来自香蕉)和FOCABB1(来自粉蕉)进行培养试验和接种试验;在含粉蕉和香蕉组织浸提液的培养基上2个菌株的培养性状、菌丝生长速度、孢子形态、大小型孢子比率和产孢量显示出差异;接种结果FOCAAA9能侵染香蕉(MusaAAA)品种巴西蕉、红香蕉和台蕉引起枯萎病,而FOCABB1对3个香蕉品种无致病性。研究结果表明侵染香蕉和粉蕉的古巴尖镰孢[Fusariumoxysporumf.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder]存在生理分化现象。