猫传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

猫传染性鼻气管炎(FIR)病毒是引起猫传染性鼻气管炎的病原,属于猫疱疹病毒1型(FHV-1)。选择FHV-1gD基因设计1对引物FHV-1F、FHV-1R和探针FHV-1Probe,建立FHV-1实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异地检测出FHV-1的DNA,敏感性达到75fg/μL,反应效率达到107%,R²值为0.9965,Ct值的变异系数低于2%。FHV-1实时荧光定量PCR检测方法敏感性高于普通PCR,特异性好、稳定性好,适用于FHV-1的临床诊断、检测和流行病学调查。利用该方法对上海地区宠物门诊送检的疑似FHV-1感染的样品进行检测,其阳性率达到27.78％,表明上海地区宠物猫FHV-1的发病率处于较高水平。     

牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。对临床收集的40份牛精液(其中8份已经鉴定为阳性)和10份牛鼻腔拭子(其中2份已经鉴定为阳性)用该体系进行检测,均得到预期结果。该方法的建立可用来对临床样品中BHV1的快速检测和实验室的质量控制。     

牛传染性鼻气管炎病毒LUXTM新型荧光PCR检测方法的建立

本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^TM引物，建立L刚新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应，而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性，检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明，LUX^TM荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0．04TCID50，比病毒分离敏感性至少提高10倍；对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品，L刚荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10^3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中，该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40TCID50牛抗凝全血、血清和临床精液中0．04TCID50的病毒，说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUXTM荧光PCR方法快速敏感，适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×10⁴～5.474×10⁹拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R²=0.999 3。该方法最低检测限为5.747×10²拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R²=0.985 4。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成GH-1、GH-2两条引物,分别以IBRV的Barta Nu/67株、IBRVBK125株基因组DNA为模板进行扩增,结果两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对其同属的伪狂犬病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒（HVT）及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）进行扩增均未见特异性条带;敏感性检测表明,该法对IBR病毒的检出限量为104.25TCID50/0.1mL.     

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法,本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物,分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并对2种方法进行了综合比较。结果显示,TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10¹ copies/μL和1.0×10² copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性;重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品,2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明,2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。     

牛传染性鼻气管炎PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列设计一对引物,进行PCR检测,并对反应条件及反应体系进行优化。结果得到与预期大小(362bP)一致的特异性片段。最佳退火温度为58～64℃,Mg2 最佳浓度为1.6mM,dNTPS为0.36mM,引物为0.2pmol/uL,聚合酶0.8U/100uL。用这对引物扩增IBRV、HCV、PRRSV、PRV,只有IBRV扩增出特异性条带。该PCR方法的检测灵敏度为2.4ng/100uL,较其他方法敏感。     

牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。     

牛传染性鼻气管炎病毒JZ06-8株犊牛感染模型的建立

为建立IBRV对犊牛的感染模型,将试验组第1组~3组犊牛通过鼻腔内喷雾接种4mL/头,病毒含量分别为107.0 TCID50/mL、106.0 TCID50/mL和105.0 TCID50/mL的IBRV/JZ06-8,阴性对照组同样方法接种MDBK细胞冻融物;攻毒后第0天~第14天,每天测定直肠温度,进行临床观察,采集鼻拭子进行病毒分离鉴定。结果显示,鼻内喷雾接种对犊牛可产生有效感染,106.0 TCID50/mL的感染剂量即可致犊牛产生典型的IBR临床症状,并可分离到IBRV。试验成功实现IBRV/JZ06-8对犊牛的感染,该模型可用于IBRV研究和IBR疫苗评价。     

牛传染性鼻气管炎病毒双重PCR检测方法的建立

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中登录的IBRV gE和gB基因序列,设计2对特异性引物。结果表明,建立的方法特异性强,对牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛和羊布鲁菌进行检测,结果均为阴性。研究表明,所建立的双重PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于IBRV的检测。     

1株牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定

在对进口种用奶牛隔离检疫期间,从1头IBRV中和抗体阳性奶牛中分离出1株病毒。该分离株表现类似于IBRV特征的细胞病变,细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞。用特异性抗IBRV阳性血清与其进行中和试验,发现IBRV标准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为27,与IBRV标准株的中和抗体滴度相差不到1个滴度。用OIEV推荐的IBR特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,表明分离到的病毒为IBRV。     

牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展

进行牛传染性鼻气管炎分子流行病学调查时,首先通过临床症状观察进行初诊,然后再进行实验室确诊。目前实验室诊断主要包括病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断方法包括包涵体检查、病毒分离和病毒核酸检测;血清学诊断方法包括中和试验、琼脂扩散试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验和变态反应。有时还要进行鉴别诊断,鉴别诊断主要有单克隆抗体法、鉴别PCR等。牛传染性鼻气管炎在世界范围内流行,给全球的养牛业造成了很大的影响。论文综述了牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展,为预防和消除该病提供参考。     

传染性牛鼻气管炎病毒分离鉴定及特性分析

传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)是牛的重要传染病病原,除能引起呼吸道疾病外,还可引起结膜炎、流产、脑炎和全身性感染。本试验从广东某牛场疑似IBRV感染牛中采取鼻拭子样品,用PCR和荧光PCR方法,初步诊断病牛感染IBRV。用MDBK细胞对初诊阳性病料进行病毒分离和鉴定,分离出1株传染性牛鼻气管炎病毒,命名为GD0109。细胞感染试验表明,该株病毒可以使MDBK细胞产生典型的圆缩、呈葡萄样聚集以及空洞等细胞病变。将GD0109与强毒的ATCCVR-2112TM株感染细胞裂解液分别接种MDBK细胞并盲传5代,对5代、10代、15代的病毒分别进行TCID50测定及中和试验,结果表明分离株和参考株VR-2112TM相似,提示该分离株为强毒株,并且具有良好的传代稳定性,为进一步疫苗生产打下良好的基础。     

牛诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛诺如病毒（BNoV）是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶（RdRp）基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×10²~2.24×10⁸拷贝·μL^-1线性关系良好,相关系数R²=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL^-1;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月-2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%（25/221）,采样场阳性率为92.86%（13/14）。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

Seroprevalence of and risk factors for infectious bovine rhinotracheitis in beef cattle herds of Yucatan,Mexico

The main objective of this cross-sectional study was to estimate the seroprevalence of infectious bovine rhinotracheitis (IBR) in a population of non-vaccinated beef cattle in the livestock region of Yucatan, Mexico and to determine potential risk factors related to the seroprevalence. Also, we estimated the intraherd correlation (r_e) and design effect (D) of IBR seropositivity. Cattle were selected by two-stage cluster sampling. Blood samples were collected from 564 animals from 35 herds. Sera were tested for antibodies against IBR using the serum-neutralisation test. Information regarding the herd and each animal sampled were recorded through a personal interview with the farmer or farm manager. The data were analysed using fixed-effects logistic multiple regression. Thirty-four of the 35 herds had at least one seropositive animal. The animal true seroprevalence was 54.4%. Animals in large herds or in production had higher odds of seropositivity than those in small herds or growing. The r_e and D were 0.17 and 3.62, respectively.     

Validation of betapropiolactone (BPL) as an inactivant for infectious bovine rhinotracheitis (IBR) virus

Infectious bovine rhinotracheitis (IBR) virus causes vulvovaginitis, abortion and respiratory disease in cows and heifers. Betapropiolactone (BPL) is a disinfectant, effective against bacteria, fungi and viruses. It is also used to prepare inactivated vaccines because it destroys the nucleic acid core of viruses but does not damage the capsid. For the validation of BPL when used as an inactivant, it is more important to assure the quality of inactivating agent and the validity of the inactivation process. In the present study, the inactivation kinetics of IBR virus was determined with different concentration of BPL (1:250, 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2000 and 1:2500) at 4 and 37 °C. The result indicated that the BPL at 4 °C was able to inactivate the IBR virus within 4, 5 and 12 h with the concentration of 1:250, 1:500 and 1:1000, respectively. BPL at 37 °C was able to inactivate virus within 30 min with the concentration of 1:250. BPL with the concentration of 1:500 and 1:1000 were able to inactivate the virus within 120 min at 37 °C. Based on the kinetic study seven formulations were prepared and a sero conversion study of IBR inactivated vaccine was carried out. Serological response in animals to different formulations did not differ significantly (P > 0.05).     

牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ｇＢ基因序列,应用ｏｌｉｇｏ４．１程序设计一对引物ＰＢ１／ＰＢ２,分别对ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲ病毒ＤＮＡ均有３９９ｂｐ的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染必喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增。均未见特异性条带,证     

实时荧光定量RT-PCR检测牛库布病毒

牛库布病毒（bovine kobuvirus,BKoV）可能是一个腹泻相关病原,目前还没有检测该病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的报道。依据BKoV 3D核苷酸序列,采用Primer 6.0设计了一对引物,通过优化反应条件和反应体系,成功建立了检测BKoV的TB Green染料法实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示此方法在4.86×10⁸~4.86×10² copies·μL^-1病毒浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999 5,扩增效率为92.75%;此方法只特异性检测BKoV,而与其他常见的腹泻病原没有交叉反应;组内及组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为4.86×10² copies·μL^-1。本研究所建的实时荧光定量RT-PCR方法对奶牛和牦牛腹泻粪便样本中BKoV的检出率明显高于已报道的3篇有关RT-PCR方法。对2018年5月-2019年5月采集自青藏高原地区（青海、西藏和四川藏区）的131份牦牛腹泻粪便样本进行检测,结果显示BKoV检出率为31.30%。首次成功建立了检测BKoV的实时荧光定量RT-PCR方法,具有良好的特异性和稳定性,且灵敏度高,为BKoV的检测及流行病学调查提供了一种新的技术手段;并且首次证实BKoV在牦牛中的流行,为牦牛腹泻的防控问题提供了参考。