Study on Agrobacterium-Mediated Transformation of Pepper with Barnase and Cre Gene

This study was designed to control plant fertility by cell lethal gene Barnase expressing at specific developmental stage and in specific tissue of male organ under the control of Cre/lox system, for heterosis breeding of chili pepper (Capsicum annuum L.). Chili pepper inbred lines (A, D, E, and I) were transformed with Cre gene and Barnase gene situated between loxp, separately, by means of Agrobacterium co-culture. In this study, we had established a high transformation system by extensive study of affecting factors including genotype, selection of marker, and lethal dose. Cotyledon with petiole from 9-11-day-old seeding was pre-cultured on media MR [MB (MS mineral+vitamine B5)+BA (6-Benzyladenine) 5.0 mg L-1 +IAA (indoleacetic acid) 1.0 mg L-1 +GA3 (gibberellic acid) 1.0 mg L-1 + sucrose 3% +agar 6.5 g L-1] for 2 d. The explants were infected by Agrobacterium tumefaciens when their OD600 (optical density at 600 nm) reached 0.6-0.9. After co-cultured for 4-5 d on media MC [MB + BA 5.0 mg L-1 + IAA 1.0 mg L-1 + GA3 1.0 mg L-1 + sucrose 3% + agar 6.5 g L-1 + AS (acetosyringone)200 μmol L-1], these cotyledons with petiole were cultured on selective differentiation medium in the media MT [MB medium supplemented with BA [5.0 mg L-1 + IAA 1.0 mg L-1 + GA3 1.0 mg L-1 + AgNO3 5.0 mg L-1 + CW (coconut water) 5% +Km (kanamycin) 65 mg L-1 + Cb (carbenicillin) 500 mg L-1 + 3% sucrose + agar 6.5 g L-1]. The Kmr (kanamycin resistant) bud rosettes were elongated on selective elongation medium and rooted on rooting medium. PCR and Southern blotting analysis of Kmr plantlet indicated that the foreign genes had been integrated into the genome of pepper. The transgenic plants with Cre gene developed well, blossomed out, and set fruit normally. The transgenic plants with Barnase gene grew well with normal appearance of flower, but they showed different fertility from complete sterility, partial sterility to complete fertility, and similar results were obtained from in vitro pollen germination experiments.     

农杆菌介导的MADS-box基因转化黄瓜初步研究

试验通过叶盘转化法,利用根癌农杆菌介导,将从黄瓜中克隆到的MADS-box同源基因—CSMADS06基因,转化到烟草和2种不同品系的黄瓜S06和S52中,经过除草剂筛选获得14株转化烟草和28株转化黄瓜。PCR检测和GFP荧光检测证实,外源的CSMADS06基因已转入这些植株中。阳性率分别为2.36%(烟草),4.1%和2.9%(黄瓜)。抗性植株已开花结果并获得子一代植株。     

辣椒雄性不育系选育及遗传研究

用1986年在8633辣椒株系中发现的雄不育株,进行测交、连续回交和父本株自交,育成了灯笼椒、羊角椒、线辣椒等不同类型的雄性不育系和相应的保持系,并筛选出恢复系。在测交过程中,发现不同品种对雄性不育的保持能力有明显差异。不育系的花明显小于保持系,不育系花药瘦小、干瘪,花粉粒无或极少,碘化反应不着色或着色极浅。扫描电镜观察表明不育系花药、花粉粒形态和表面结构异常。雄性不育属核质互作型,细胞核中有一对隐性基因控制雄不育性。雄性不育系基因型为 Smsms,保持系的基因型为 Nmsms。     

甜椒胞质雄性不育(CMS)系及其保持系花药中游离氨基酸含量

分析了不同核背景的甜椒胞质雄性不育(CMS)系ZTA、17A、8A和相应保持系ZTB、17B、8B花药中17种游离氨基酸,结果表明:不育系花药中游离脯氨酸和游离赖氨酸含量均明显低于相应的保持系;不育花药中严重缺乏游离脯氨酸;不育花药中游离苏氨酸和精氨酸含量均明显高于相应保持系的可育花药;不育系花药中游离氨基酸总量则明显低于保持系。核遗传背景差异导致3份同质异核甜椒不育系花药中同种游离氨基酸含量间存在差异。     

线辣椒成熟果色黄色性状遗传规律

以线辣椒黄色突变体H0809为母本材料,野生型XHB(红色)及红色高代自交系CP1211-1、CP12332-5、CP1235-11、 CP1245-6、CP1256-10、CP1271-3为父本材料,配制杂交组合,对亲本、不同组合F_1代及F_2代分离群体的果实颜色性状进行调查与分析。结果表明,各组合F_1代群体辣椒果实颜色均为红色,说明辣椒果实红色对黄色为显性, F_2代分离群体红色和黄色单株数量符合孟德尔3∶1的分离比例,表明线辣椒成熟果色黄色性状受1对隐性基因控制,黄色线辣椒H0809为红色野生型XHB的隐形突变。     

海南高产甜椒杂交制种技术研究

对海南特定气候特点下影响甜椒杂交制种的几个环节进行了详细研究,结果表明:以开花前1d去雄、第2d早上授粉单果饱满种子数最多;摄子去雄、不去花瓣,摄子去雄、去部分花瓣,徒手去雄3种去雄方法对座果率、种子数差异不显著;空气相对湿度大于70%,温度25~30℃花粉发芽率较高;完全转色种果的种子发芽率最高,后熟作用对发芽率影响不大,而始转色果和绿熟果随着后熟时间的增加,发芽率逐渐升高;完熟果种子在常温保存200d后发芽率几乎不变,而绿熟果和始转色果则下降较快针对上述结果提出了提高制种纯度和产量的相关方案和措施     

专用生物菌剂和有机冲施肥对辣椒幼苗生长的影响

以辣椒(Capsicum annuum L.)品种苏椒14为试验材料,进行专用生物菌剂宁盾和有机冲施肥真根的苗期喷施处理,测定其生物量、根系和土壤微生物的变化。结果表明,有机冲施肥处理显著提高了辣椒幼苗的株高、茎粗和叶面积;专用生物菌剂和有机冲施肥都显著提高了辣椒幼苗的地上部和地下部的鲜重和干重。从对根系的影响来看,宁盾、真根处理根表面积和分叉数与对照差异显著。与原始土样相比,宁盾处理后辣椒根际土壤中的细菌、放线菌、真菌的数量均明显增加。由此可见,施用有机冲施肥对辣椒幼苗地上部和地下部的生长促进作用更明显,施用专用生物菌剂可以改善植物根际土壤环境。     

辣椒细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA的RAPD分析

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为试材,从苗龄10~15 d的黄化苗中分离纯化线粒体并提取线粒体DNA。线粒体负染后电镜观察发现,分离纯化的线粒体形态完整,呈椭球形,杂质较少。电泳检测提取的线粒体DNA的琼脂糖,结果表明,线粒体DNA纯度较高,无降解现象,浓度为20~50 ng/μl,可用作RAPD分析。经初步筛选,100个RAPD随机引物中有8个引物表现出多态性,经再次重复筛选,获得了辣椒细胞质雄性不育系21A线粒体DNA与雄性不育性相关的RAPD标记CMSAG3430。     

以诺丽茎段为外植体的无籽基因转化研究

以诺丽无菌苗不带腋芽的茎段为转化材料,采用根癌农杆菌介导法,将含有无籽基因的质粒pCAMBIA1305.1导入到诺丽细胞中,通过Kan快速筛选、PCR检测等方法对转化子进行鉴定.实验结果表明:抗性芽的平均分化频率为42%,经过PCR检测,以茎为外植体进行遗传转化的转化率为5.4%.在转化过程中,有些植株可能会发生饰变.该实验初步证实已把无籽基因转入诺丽,后续需Southern杂交进一步验证.     

基于不同策略构建辣椒核心种质的研究

核心种质的构建为作物种质资源的高效利用提供了便利条件。以420份辣椒(Capsicum annuum L.)种质为试材,采用混合线性模型分析方法无偏地预测11个数量性状的基因型值,利用马氏距离计算种质间的遗传距离,分别采用3种聚类方法(中间距离法、类平均法和离差平方和法)、3种抽样方法(随机抽样法、优先抽样法和偏离度抽样法),按照25%的抽样比率构建辣椒核心种质库,采用均值、方差、极差和变异系数4个指标评价不同方法构建核心种质库的优劣。结果表明,类平均法优于中间距离法和离差平方和法,偏离度抽样法优于随机抽样法和优先抽样法。基于马氏距离、类平均法、偏离度抽样法获取的105份辣椒核心种质资源能够代表原群体的遗传多样性,为辣椒种质资源的高效利用提供了重要的理论依据。     

远红光补光对辣椒幼苗生长和非生物胁迫抗性的影响

【目的】研究补照适量远红光（FR）对辣椒幼苗生长发育和非生物胁迫抗性的调控作用,旨在为实际生产过程中利用精确的光环境调控手段培育壮苗提供理论依据。【方法】以辣椒‘博辣红帅’品种为研究材料,将苗龄7 d的辣椒幼苗置于LED光源对照光谱（NL;红R/蓝B=3/1,光量子通量密度PPFD为150 μmol·m^-2·s^-1）及在此基础上分别补充10 μmol·m ^-2·s^-1远红光（6% FR）、20 μmol·m ^-2·s^-1远红光（13% FR）和30 μmol·m ^-2·s^-1远红光（20% FR）的处理组光谱环境条件下培养,并于苗龄21 d时进行低温和干旱处理。通过测定生物量、抗性相关基因表达、抗氧化酶活性、激素含量、叶绿素荧光参数以及叶片相对电导率等,探究补充6% FR对辣椒幼苗生长和非生物胁迫抗性的影响。【结果】与对照光谱相比,补充6% FR显著提高了辣椒幼苗株高、茎粗、干鲜重以及壮苗指数（P<0.05）。低温胁迫下,相比于对照光谱组,补充6% FR显著提高了辣椒叶片冷响应基因CBF1和抗氧化酶相关基因Cu/Zn-SOD、GR、APX、CAT、DHAR的表达水平,超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性比对照分别增加25.2%、53.6%、55.8%、72.7%和33.4%,抗逆相关激素脱落酸（ABA）的含量提高69.5%。同时,低温胁迫下补充6% FR后辣椒叶片PSII最大光化学效率（Fv/Fm）较对照光谱组显著升高,而相对电导率（REL）显著降低,表明补充6% FR缓解了低温下PSII光抑制和叶片细胞的损伤,提高了辣椒幼苗的耐冷性。此外,干旱胁迫下,相比于对照光谱组,补充6% FR使辣椒幼苗的抗氧化酶SOD、GR、APX、CAT、DHAR活性分别增加13.7%、38.0%、37.2%、27.6%和23.7%,ABA含量和PSII实际光化学效率（Φ_PSII）也显著升高,而REL则明显降低,表明补充6% FR减轻了干旱胁迫引起的PSII光抑制和膜脂过氧化,提高了辣椒幼苗的耐旱性。【结论】补充6% FR不仅可促使辣椒壮苗的形成,还可通过增加抗氧化酶活性和ABA含量提高辣椒幼苗对低温胁迫和干旱胁迫的抗性。     

线辣椒SSR-PCR反应体系优化及多态性标记筛选

以循化线辣椒果实黄色突变体H0809和高代自交系0599-1为试材,采用L_9(3~4)正交试验设计,研究线辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并对420对SSR分子标记进行筛选。结果表明,最优的反应体系为:总体积20μL,基因组DNA 20 ng,dNTP 100μmol·L~(-1),引物0.6μmol·L~(-1),Mg~(2+)2.5 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶1.5μmol;通过筛选,获得72对具有多态性的SSR标记,多态性率为17.1%,平均每个标记扩增出2.67个等位基因。本试验建立的SSR-PCR反应体系和筛选的多态性标记可用于线辣椒种质资源分析、分子标记辅助育种、分子遗传图谱构建及基因克隆等研究。     

碳源组分及浓度对辣椒花药培养的影响

以编号为ZF-09、ZF-10两个辣椒品种的F1代为试材进行花药培养,研究碳源组分及浓度对辣椒花药培养出胚率及出苗率的影响,并对获得再生植株进行倍性鉴定.结果表明,Cp+蔗糖浓度1%+麦芽糖浓度2%的培养基出胚率及出苗率在ZF-09和ZF-10两品种中均为最高.ZF-09出胚率及出苗率分别达到CK的2.3倍和7.14倍,而ZF-10出胚率及出苗率分别达到CK的3.7倍和11.06倍;采用根尖染色体计数鉴定再生植株中倍性组成, ZF-09二倍体发生率为60.3%,单倍体发生率为39.7%;ZF-10二倍体发生率为68.4%,单倍体发生率为31.6%.     

辣椒 CaTPS8 基因克隆与表达分析

海藻糖-6-磷酸合酶（Trehalose-6-phosphate synthase, TPS）在植物非生物胁迫响应中起着重要的调控作用。以辣椒品种‘强丰101’为材料,对 CaTPS8 基因进行克隆和表达分析。结果表明,该基因CDS的完整开放阅读框为2 553 bp,编码850个氨基酸。生物信息学分析发现,CaTPS8蛋白的分子质量为96 ku,理论等电点为5.65,不稳定系数为48.09,推测为不稳定蛋白。蛋白结构预测显示CaTPS8蛋白包含Glyco_transf_20和 GT20_TPS两个保守结构域,属于亲水性蛋白,没有跨膜结构和信号肽序列。二级、三级结构预测表明该蛋白的结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。系统进化关系分析表明, CaTPS8蛋白与马铃薯和番茄的同源性最高,其相似度分别为87.78%和86.92%,与高粱的同源序列相似度最低,为64.76%。实时荧光定量PCR分析表明, CaTPS8 基因在辣椒花中表达量最高。同时, CaTPS8 基因的表达受到低温的诱导,在处理 3 h时相对表达量最高,约为对照的25倍。此外,IAA、ABA、SA、GA₃和MeJA处理能够抑制 CaTPS8 基因的表达。研究结果为进一步阐明 CaTPS8 基因响应辣椒非生物胁迫的分子机理奠定基础。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

双价表达载体转化辣椒的体系优化

将含有PamPAP和Cry2Aa2的双价表达载体通过农杆菌介导法转化辣椒,并对其遗传转化体系进行优化,从而建立辣椒Flamingo-bill农杆菌介导的高效遗传转化体系。结果表明：Flamingo-bill外植体的不定芽容易伸长,不定芽分化率明显高于带柄子叶;延迟筛选4~6d可显著提高Flamingo-bill外植体不定芽的分化率和抗性率;Flamingo-bill外植体最适筛选浓度为甘露糖18g/L和蔗糖12 g/L;抗性苗生根最佳培养基为MS+0.2 mg/LNAA+     

枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因转化小麦的研究

 【目的】尝试将枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因（SacB）导入小麦品种（系）02-371、02-207、郑麦9023和东农7742以提高其耐旱性。【方法】利用农杆菌介导法转化小麦幼胚愈伤组织，将SacB基因导入4个小麦品种，并对转化植株进行PCR和Southern杂交检测。【结果】SacB基因已整合到受体小麦的基因组中。转基因植株整合目的基因的拷贝数多为1～2个。4个受体小麦品种（系）02-371、02-207、郑麦9023和东农7742的转化频率分别为0.88%、1.48%、1.04%和1.23%。RT-PCR检测结果表明，SacB基因在部分转基因植株中得到表达，并使转基因小麦植株的耐干旱胁迫能力明显提高。【结论】向小麦中导入枯草杆菌SacB基因可增强其耐旱性。     

丛枝菌根真菌对淮安红椒连作土壤养分和酶活的影响

在分析淮安红椒(Capsicum annuum L.)连作10年大棚土壤养分含量和土壤酶活性的基础上,研究了根际施用不同量丛枝菌根真菌对土壤有机质、有效养分和酶活的影响,探讨了丛枝菌根真菌修复淮安红椒连作障碍的可能性及其机理。结果表明,连作土壤中有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量显著升高,脲酶、蔗糖酶、蛋白酶、过氧化物酶、脱氢酶活性显著降低,而过氧化氢酶活性显著升高;每株施用3、5g丛枝菌根真菌能够促进红椒对土壤有机质和有效养分的吸收,使土壤中有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量显著降低,能够改善根际土壤微生态,显著提高土壤脲酶、蔗糖酶、蛋白酶、过氧化物酶和脱氢酶活性,从而降低过氧化氢酶活性;丛枝菌根真菌能够显著缓解淮安红椒连作障碍。     

利用分子标记鉴定萝卜细胞质雄性不育种质的研究

利用萝卜包含ORF138基因片段的Ogura胞质雄性不育（CMS）分子标记对收集的5份萝卜雄性不育系种子材料进行鉴定。结果表明,有1份种质为Ogura雄性不育材料;将Ogura分子标记应用子萝卜Ogura细胞质雄性不育基因的转育工作中,可以提高选择效率,缩短育种年限。其它4种萝卜种质的不育类型和相关遗传机制,有待于进一步鉴定和分析。     

短时低温胁迫对甜椒叶绿体超微结构和光系统的影响

 通过测定荧光参数、膜脂脂肪酸组成、活性氧及相关清除酶活性，研究了短时低温（4 oC）胁迫对冷敏感甜椒叶片光系统的影响。结果表明，6 h低温弱光（100 μmol·m-2·s-1）胁迫结束时光系统II（PSII）最大光化学效率（Fv/Fm）下降35.6%，氧化态的P700下降约60%，而暗中低温处理对二者没有影响。低温弱光胁迫对膜脂脂肪酸组成和叶绿体超微结构的影响均比暗中低温胁迫严重，而活性氧清除酶的活性有所下降，活性氧积累。因此，叶绿体膜系统的完整性与活性氧积累之间可能存在一定的相互关系。低温弱光胁迫引起了PSII和PSI的光抑制，而活性氧的积累可能是氧化态P700下降的一个原因，而且PSI对低温弱光比PSII表现得更敏感。