拟南芥PTR3基因过表达载体构建及转基因植株的获得

[目的]构建PTR3基因的过表达载体,并建立PTR3基因过表达植株,为进一步研究PTR3基因在调控重金属胁迫应答中的功能提供理论依据。[方法]提取野生型拟南芥总mRNA,并以反转录的c DNA为模板扩增出PTR3基因CDS全长,通过限制性核酸内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接,将该基因连接到带有35S启动子的p BI121载体上。[结果]将重组载体转化至农杆菌GV3101菌株,通过浸花法将重组载体转化到野生型植株中,通过抗性筛选和遗传鉴定获得纯合的PTR3转基因阳性植株。[结论]PTR3过表达载体构建成功并获得转基因阳性植株,为研究PTR3基因的分子功能奠定基础。     

拟南芥DREB1A基因的克隆与植物表达载体构建

用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,序列分析发现,所克隆的DREB1A基因与已发表的DREB1A基因序列(AB007787)的同源性为99.69%.利用基因重组技术成功构建了植物表达栽体pBI121-DREB1A,为进一步利用DREB1A基因综合改良植物抗旱性奠定了基础.     

拟南芥WRI1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了拟南芥WRI1基因,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因全序列.结果表明,该基因全长为1 287 bp.将拟南芥WRI1基因反向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体.     

蚕豆VfGASA1基因的异源过表达延迟拟南芥开花

GASA(Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis)蛋白是一类受赤霉素调控的小分子蛋白质,参与植物生长发育的多条途径.本研究在蚕豆(Vicia faba)中同源克隆了VfGASA1基因,该基因的开放阅读框全长为363 bp,编码1个包含120个氨基酸残基的蛋白质,VfGASA...     

拟南芥AtNHX1基因克隆和cre(lox)植物表达载体构建

从拟南芥叶片提取总RNA,经反转录得到cDNA。根据Genbank数据库中已登记的拟南芥Na /H 逆向转运蛋白基因AtNHX1的核苷酸序列设计并合成了1对克隆引物,通过PCR方法从cDNA中扩增出AtNHX1基因片段,将该目的片段克隆至pGEM-TEazy载体。通过酶切,从pGEM-TEazy载体上切下目的基因片段,替换pX6-GFP载体中的GFP基因,构建了AtNHX1基因cre/lox植物表达载体。     

草莓FaAP1基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达

为研究草莓AP1同源基因FaAP1的功能,构建了其植物表达载体pBI121-FaAP1,并导入到农杆菌菌株GV3101中。利用花序浸染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了3个转化株系。结果显示,与对照相比,转基因株系明显早花,成花时间可提早10d以上;同时其营养生长受到抑制,植株个体矮小,莲座叶数目减少;在早花的同时,转化株系花器官异常,不能形成种子。表明草莓FaAP1基因参与了成花过程的调控。     

一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。     

拟南芥CBF1基因植物表达载体构建及其对野生蕉的遗传转化

从拟南芥中克隆CBF1基因,转入到植物表达载体pBI121的XbaI和SacI位点,得到中间重组质粒pBI121-CBF1,用EcoRI和HindⅢ将35S启动子与CBF1基因从pBI121-CBF1切下,转入到植物表达载体pCAMBIA1301中,构建植物表达载体p1301-CBF1.将构建的植物表达载体转入农杆菌E...     

一个抗旱/抗寒基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究LWT1基因在调控低温和干旱应答中的功能,构建拟南芥LWT1基因过表达载体,获得相应的转基因株系.[方法]以野生型拟南芥的cDNA为模板,利用PCR扩增LWT1基因全长,将该基因连接到pART27载体上.将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸花转化法将LWT1重组载体转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得LWT1转基因阳性植株.[结果]LWT1基因CDS全长990 bp,PCR电泳结果一致,测序比对结果正确.通过抗性筛选和分子鉴定获得转基因植株.[结论]LWT1过表达载体构建成功并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础.     

棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶.采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase基转移酶β-CT亚基编码基因αccD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列.将CAC3基因转运肽序列与αccD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-αccD.重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101.渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选.用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,荻转基因烟草植株.T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录.     

甘蓝过量表达硝酸还原酶基因对硝酸盐积累的影响

为探索过量表达硝酸还原酶基因对甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)硝酸盐积累的影响,以‘中甘11号’下胚轴为外植体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将烟草硝酸还原酶基因(NR)导入甘蓝,获得13株卡那霉素抗性植株。PCR和Southern blot检测证实,NR基因已经成功导入并整合到甘蓝的基因组。4个转基因株系硝酸盐质量分数明显低于非转基因供体株系,降幅为13.9%~23.0%。说明:将重组硝酸还原酶基因导入甘蓝且得到超量表达,创制低硝酸盐育种材料的方法可行。     

大豆查尔酮还原酶GmCHR基因的克隆及其在烟草中的表达

以大豆品种"吉农28"为材料,利用RT-PCR技术获得GmCHR基因序列,并选择其中918 bp的开放阅读框,以pBI121为基础载体,构建了由35S启动子驱动的GmCHR植物表达载体,转入烟草中并对17株抗卡那霉素的转基因烟草进行PCR、GUS染色、Southern杂交检测,对植株中GmCHR基因mRNA表达量进行荧光定量PCR检测,采用高效液相色谱技术测定转基因植株中查尔酮还原酶催化产物异甘草素的含量。结果表明:GmCHR基因成功整合到烟草基因组中并能够成功表达;在转基因植株中目的基因的mRNA均有表达,且不同植株间表达量存在差异;转化烟草叶部组织中异甘草素的平均含量为(7.528±0.018)μmol/g,而转空载体烟草中未检测出异甘草素。     

植物OST1基因功能研究进展

植物在生长过程中会遭受各种逆境胁迫,环境胁迫会引起植物体内一系列的信号反应,其中脱落酸(ABA)信号途径是一条重要的胁迫应答途径。作为ABA信号通路中的蛋白质激酶之一,气孔开放因子1(Stomatal opening factor 1,OST1)在植物逆境应答反应中扮演重要角色。因此,研究OST1基因在植物逆境应答中的功能有助于阐述植物耐逆分子机制。从OST1的相互作用因子及其在信号通路中的调控作用等方面进行阐述,对其介导的逆境应答机制进行了系统总结。     

植物耐寒基因ICE1的克隆

通过对耐寒相关基因进行转基因,可以提高植物的耐寒性。为使烟草提高耐寒性,本研究根据GeneBank中公布的ICE1序列设计引物,以拟南芥cDNA为模板克隆了植物耐寒基因ICE1(全长1485bp),经PstI酶切检测克隆到的ICE1序列和GeneBank公布的一致。为我们下一步构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草奠定了基础。     

热激因子基因AtHSFa1a提高烟草的耐热性研究

克隆了拟南芥热激因子AtHSFa1a,并由热激启动子AtHSP70b控制,构建了双元表达载体pV-70bAtHSFa1a,并经农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株,并检测了其耐热性指标.结果显示:与对照相比,转基因烟草的电导率较低,丙二醛含量增幅较小,SOD酶活性较高,初步表明其对高温具有更高的耐受性.     

GEF7基因过表达拟南芥植株幼苗表型分析

利用已构建的过表达拟南芥(Arabidopsis)GEF7基因植株,在光照培养箱中进行培养,并与野生型植株进行对比分析,对GEF7基因过表达植株的幼苗表型进行了观察分析。结果表明,GEF7基因过表达植株幼苗的根长比野生型对照明显增加;其子叶形态、数目和幼苗形态等方面均有异常表型,表明GEF7基因的功能与根的发育有关,并参与调控植物的发育过程。     

超表达硒代半胱氨酸甲基转移酶基因对烟草硒酸盐胁迫的生理效应

研究了硒酸钠(Na2SeO4)对转硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)基因烟草和普通烟草生长以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响.结果表明,不同浓度硒处理转基因烟草的鲜重和株高均高于普通烟草,一定浓度范围内转基因烟草的GSH-Px活力受硒影响的程度低于普通烟草.方差分析表明,在20mg·L-1硒处理下,转基因烟草和普通烟草的鲜重、株高差异显著,转基因烟草的鲜重和株高分别是普通烟草的1.96倍和1.80倍:在10 mg·L-1、20 mg·L-1硒处理下,普通烟草的GSH-Px活力均极显著地高于转基因烟草,前者GSH-Px活力分别是后者的1.65倍和2.48倍.显示SMT基因的转入改善了烟草对硒的耐受性.     

黄瓜叶酸合成关键基因克隆与分析

【目的】分析黄瓜基因组中与叶酸合成代谢相关的基因数量、定位以及表达特征,对关键酶基因进行生物信息学分析与克隆,旨在为黄瓜叶酸合成调控研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥叶酸合成相关基因,利用黄瓜基因组数据库中9930_V3版本进行BLAST比对。利用MapChart绘制黄瓜染色体物理图谱并对基因定位。利用qRT-PCR分析这些基因在黄瓜果实发育不同时期和不同材料中的表达量。通过MEGA、WebLOGO、ExPASy等工具对关键酶基因进行生物信息学分析。通过PCR扩增对关键酶基因进行克隆,并测序分析基因的序列差异。【结果】同源比对获得19个黄瓜叶酸代谢相关基因,这些基因不均匀分布在黄瓜7条染色体上,且以Chr.4和Chr.5上分布最多。通过对其中11个调控叶酸合成的基因在测序黄瓜9930果实发育不同时期以及果实叶酸含量高低差异显著的2份材料的表达量分析,发现CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS和CsDHNA 3个基因与果实叶酸含量变化趋势完全一致;CsADCS、CsADCL、CsDHNA、CsHPPK/CsDHFS、CsFPGS、CsDHFS等基因的表达量在2份材料中具有显著差异。通过对2个调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因CsGCHI和CsADCS的蛋白序列及蛋白结构域分析,发现各物种中CsGCHI的同源基因均具有2个GTP_cyclohydroI结构域;CsADCS的同源基因均具有2个GATase结构域、1个Anth_synt_I_N结构域和1个Chorismate_bind结构域。它们在不同物种中高度保守,进化树分析亲缘关系近的物种聚类到一起。分别扩增黄瓜果实低叶酸含量自交系65G和高叶酸含量自交系02245中CsGCHI和CsADCS的同源基因,序列分析表明CsaV3_1G041250全长为3 012 bp,CDS序列长度为1 413 bp,3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的变异;CsaV3_7G026240全长为3 047 bp,CDS长度1 407 bp,序列无变异;CsaV3_5G036360全长7 941 bp,CDS序列长度为2 706 bp,序列无变异。【结论】鉴定出19个不均匀分布在7条染色体上的黄瓜叶酸代谢相关基因,基因CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS 、CsDHNA和CsADCS是影响黄瓜果实叶酸含量变化、导致叶酸含量高低显著差异的关键基因,调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因GCHI及ADCS功能相对保守,CsGCHI在65G、02245中有3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的差异。