正交设计在杨树最佳遗传转化体系的建立

本试验以建立的南林95杨高频再生体系为基础,利用正交试验设计,通过GUS组织染色分析法研究了预培养时间、茵液浓度、As浓度、侵染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对南林95杨遗传转化的影响,并探讨了南林95杨转化中添加卡那霉素的适宜浓度。运用DPS软件对试验结果进行分析,建立了杨树遗传转化体系。结果表明：外植体预培养7d,在含As200μmol／L的茵液浓度为0．6的农杆菌液中侵染20rain,共培养3d为最佳遗传转化体系,适宜的卡那霉素筛选浓度为50mg／L;本试验共获得6株转化植株,经GUS染色检测和PCR分析表明．GUS基因已初步整合进入南林95杨基因组中。     

山新杨钾离子通道基因PdbSKOR的克隆与功能分析

【目的】植物SKOR是典型的外向整流型Shaker类钾离子(K+)通道蛋白,介导根部K+向地上部的长距离运输。本研究克隆并鉴定杨树K+通道基因Pdb SKOR,在转录水平探讨其组织特异性表达特征及对缺钾、高钾、干旱和低温胁迫的响应情况,并明确其电生理学功能。【方法】通过同源克隆法,在山新杨中鉴定并克隆1个K+通道基因Pdb SKOR;运用MEGA 7.0软件构建山新杨等14种不同科属木本植物SKOR通道成员的系统进化树;利用实时荧光定量PCR分析Pdb SKOR的组织特异性表达特征及在转录水平根部Pdb SKOR对缺钾、高钾(60 mmol·L-1KCl)、干旱(15%PEG6000)和低温(4℃)处理的响应情况;借助膜片钳系统研究Pdb SKOR的电生理功能。【结果】在山新杨中克隆1个K+通道基因Pdb SKOR(Gen Bank No. MT335814),其编码蛋白含有6个离子通道跨膜域(S1—S6)、环核苷酸结合域、Ankyrin锚蛋白域和KHA二聚体功能结构域,属于典型的Shaker类K+通道; 14种木本植物SKOR蛋白的氨基酸一致性高达81.09%,S6跨膜区的氨基酸一致性最高(96%);不同科属植物的SKOR同源蛋白在遗传进化关系上差异较大,而同一科属植物的遗传距离较近,山新杨PbdSKOR与同属杨柳科的红皮柳的同源蛋白Spu SKOR的遗传距离最近;在Pdb SKOR启动子区域预测到18种顺式作用元件,主要包括发育调控、激素响应和胁迫响应等相关的调控元件;实时荧光定量PCR表明Pdb SKOR在3年生山新杨根部的相对表达量最高,其次是盛开期花和花序,在茎部、叶片和果絮中的表达量相对较低; Pdb SKOR在组培幼苗根部的表达水平也是最高的,且在转录水平对高钾处理没有响应,但对缺钾、干旱和低温胁迫处理较为敏感,其中,Pdb SKOR在幼苗根部的表达水平受缺钾或干旱处理的抑制均显著降低,受低温胁迫诱导而显著增强;膜片钳研究表明当细胞膜电位为+20 m V时,PdbSKOR离子通道即被激活,并记录到典型的外向整流电流,并随胞外K+浓度的降低而增大,且正向电压越大,内向整流的电流越强,表明PdbSKOR是一个电压依赖的外向整流型K+通道。【结论】从山新杨中克隆并鉴定了1个K+通道基因Pdb SKOR;山新杨PdbSKOR与红皮柳Spu SKOR在系统进化关系上最近; Pdb SKOR主要在山新杨根部(成年树和幼苗)表达,幼苗根部Pdb SKOR在转录水平受缺钾、干旱和低温胁迫的调控; PdbSKOR是山新杨根部主导K+外排的通道。     

家蚕来源肠球菌RAPD反应体系的优化

通过调整 Mg2 、DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs的浓度及PCR反应循环次数,建立并优化了家蚕来源肠球菌的RAPD-PCR反应体系及条件.结果表明,在25 μl反应体系下,当Mg2 的浓度为3.5 mmol/L、DNA模板加入量为50 ng、引物浓度为15 pmol/L、Taq DNA聚合酶加入量为3U、 PCR反应循环次数为45时,扩增结果最好.在本实验室,为家蚕来源肠球菌的遗传多样性研究建立了一种最佳RAPD分析模型.     

以beta-tubulin基因为选择标记的淡紫紫孢菌遗传转化

[目的]建立稳定的食线虫真菌淡紫紫孢菌遗传转化体系，并获得插入突变体。[方法]介导的方法，以淡紫紫孢菌20-7的分生孢子为受体，将新构建的携带beta tubulin基因的质粒转化进入淡紫紫孢菌的细胞中，通过优化诱导乙酰丁香酮(AS)的浓度、诱导培养时间、农杆菌终浓度OD₆₆₀值、共培养AS的浓度、共培养时间和共培养温度等因子，建立高效遗传转化体系，获得致病力不同的突变体。[结果]共培养过程中使用萌发孢子是成功建立淡紫紫孢菌遗传转化体系的必要条件；淡紫紫孢菌萌发的孢子与农杆菌EHA105在25℃共振荡培养48 h时，且在共培养阶段当乙酰丁香酮浓度为200μg·mL^-1(pH5.5)时转化效率最高，转化效率为1 200～3 200个转化子/10⁶分生孢子，阳性抗性转化子比率为96%；转化子PCR表明，T-DNA已整合到淡紫紫孢菌的基因组中；Southern杂交验证表明，83.3%的转化子为T-DNA单拷贝插入；成功建立了可靠的淡紫紫孢菌的遗传转化体系，并从20个转化子中筛选到16个致病力变异的突变体。[结论]本研究成功构建...     

香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立

通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立香樟胚性愈伤组织遗传转化体系.结果表明:以胚性愈伤组织为受体,能取得比较理想的转化效果;50 mg·L-1的潮霉素对胚性愈伤组织有很好的筛选效果;根癌农杆菌OD600为0.6时,能获得较高的转化率;侵染时间提高为40min时,对提高转化效率有显著的效果;共培养3 d能够得到较好的转化效率.对转基因香樟愈伤组织进行PER检测,结果表明GUS基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组中.     

枫香优良观赏种质的遗传多样性分析

利用ISSR标记技术对12份枫香观赏种质进行遗传多样性分析,通过正交实验优化枫香的ISSR-PCR扩增体系,即在20μL体系中加入PCR反应缓冲液2μL、镁离子1.5 mmol.L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U、dNTP 0.15 mmol.L-1、引物0.4mmol.L-1、DNA模板80 ng。筛选出的19条ISSR引物共得到131条扩增带,其中多态性条带为94条,多态性条带比率为71.75%。12份种质的有效等位基因数是1.482,基因多样性0.3012,Shannon信息指数0.4674,表明遗传多样性水平相对较高。进一步的聚类将这些种质分成3类,其中4号样本和11号样本的遗传相似度最高。     

冰糖橙成年态节间茎段遗传转化体系的建立

以柑橘成年态材料作为外植体进行遗传转化试验对遗传改良性状的早期评估是非常有利的,尤其是无核的品种如冰糖橙。本试验旨在建立一套冰糖橙成年态节间茎段再生及遗传转化体系,材料取自温室中嫁接于枳上的成年态植株。结果表明：新改良消毒处理可将外植体死亡率从27.2%降低为0,成活率从60%升高到80%左右;当采用MS＋2ip 2 mg.L-1＋2,4-D 2 mg.L-1共培培养基及MS＋6-BA 3 mg.L-1再生培养基进行不定芽的诱导时,不定芽再生率最高为47.89%,在进行转化试验时,再生培养基需加入30 mg.L-1卡拉霉素和500 mg.L-1头孢霉素;采用3种方法将不定芽嫁接到14 d枳橙砧木上,其中微型嫁接中＂改进的‘⊥’压法＂可使嫁接成活率达到90%;通过上述方法,本试验将chit42基因转入冰糖橙中,并通过PCR检测,表明目的基因的成功导入,其转化率达到了7.6%。     

农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系

【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基。在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L_(16)(4~5)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。【结果】再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,诱导率为83%±10. 0%;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,平均伸长长度为(2. 47±1. 33) cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L~(-1),筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L~(-1)。转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽; GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。【结论】杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA+200 mg·L~(-1)Cef+70 mg·L~(-1)Km。利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。     

不同抗生素的浓度对百合鳞片再生的影响

以兰州百合、OT型百合“木门”及东方百合“索邦”试管鳞茎的鳞片为外植体,在分别添加不同浓度头孢噻肟钠(Cef)、卡那霉素(Kan)和潮霉素(Hyg)的芽诱导培养基上进行培养,研究不同抗生素及其浓度对百合鳞片存活及再生的影响,筛选适宜的抗生素种类和浓度,为百合遗传转化和组培过程中细菌污染控制提供依据。结果表明,Cef对百合鳞片再生的影响较小,300 mg/L的Cef可用作农杆菌介导的遗传转化及组培快繁过程中细菌污染的脱菌剂;Kan对百合鳞片再生有较强的抑制作用,兰州百合最适宜的筛选浓度为40 mg/L,而“木门”和“索邦”适宜的筛选浓度为100 mg/L;Hyg对百合鳞片具有较强的致死作用,以Hyg为筛选标记进行兰州百合遗传转化时适宜的筛选浓度为25 mg/L,“木门”和“索邦”适宜的筛选浓度为35 mg/L。     

农杆菌介导BADH基因转化美丽胡枝子的研究

以子叶节为外植体,草丁膦为选择剂,对根癌农杆菌LBA4404介导的美丽胡枝子遗传转化进行研究,建立美丽胡枝子遗传转化体系,获得转BADH基因植株,最高转化率可达28%.抗性植株经分子检测表明,目的基因已整合进美丽胡枝子基因组中.NaCI胁迫下,转基因植株能积累更多的甜菜碱,证明BADH基因在转化植株中得到正常表达.     

农杆菌介导的喜树遗传转化(英文)

利用农杆菌介导法将与植物纤维素合成有关的纤维素合成酶基因导入喜树体内,并对影响遗传转化效率的几个因子进行了研究,建立了有效的喜树遗传转化体系。采用预培养的外植体在OD600(0.5)的农杆菌菌液中侵染10分钟,外植体与农杆菌侵染后在再生培养基上与农杆菌共培养三天,然后转入筛选培养基,获得了最佳的转化效率。Southern杂交结果证明UGPase基因已经整合到喜树的基因组中。在最佳的转化条件下获得了 6%的转化效率。这个转化系统对于利用遗传转化对喜树进行遗传改良是非常有意义的。     

红豆杉TbAP2基因荧光定量PCR体系的建立及优化

[目的]建立稳定可靠的、适合检测红豆杉(Taxus L.)TbAP2基因表达量的荧光定量PCR实验体系。对于检测该物种中基因的组织特异性表达具有重要意义。[方法]以曼地亚红豆杉细胞为试材,提取总RNA并反转录为cDNA,根据TbAP2基因序列设计多对引物,合成内参基因TBC41的引物,采用正交试验L_9(3~4)方法分别筛选以上2个基因5μL和10μL小反应体系及20μL常用体系中的最佳组合,并通过cDNA模板用量和引物用量等方面进行优化,以确保基因扩增效率在90%～105%之间。[结果]本研究建立了TBC41和TbAP2基因在5、10、20μL体系下的荧光定量最佳PCR反应体系,在优化后的5μL体系下,加入Mix(2×) Universal 2.5μL,cDNA模板1.0μL,正反引物共1.5μL,内参基因TBC41和目的基因TbAP2的扩增效率均为94%;在优化后的10μL下,加入Mix(2×) Universal 5μL,cDNA模板1.2μL,正反引物共1.3μL,TBC41和TbAP2的扩增效率分别为95%和94%。在优化后的20μL下,加入Mix(2×) Universal 10μL,cDNA模板0.5μL,正反引物共1.5μL,TBC41和TbAP2的扩增效率分别为93%和99%,以上各扩增体系回归系数R~2均大于0.980。[结论]在以上3种反应体系下,内参基因和目的基因均具有接近100%的扩增效率,表明本研究成功建立了适合检测红豆杉TbAP2基因表达量的荧光定量PCR实验体系,并为红豆杉其它基因的表达研究提供参考。     

利用山新杨萌生枝叶片建立无菌系的研究

以山新杨(24年生)优树的2年生萌生枝上的叶片为材料,进行了不同培养基及不同影响因子对山新杨叶片不定芽再生能力影响试验,结果表明:山新杨叶片再生的最适合培养基是1/2MS+BA0.5 mg.L-1+NAA0.1~0.2 mg.L-1,再生频率达100%,叶片培养的最佳取材部位是树枝茎尖展叶开始第1~3片叶;叶片正面向上或向下接种的培养基,对其形成不定芽无显著影响。     

南方四季杨高效遗传转化体系的建立

以南方四季杨叶片作为受体材料,分别设置梯度实验,研究了Kan(卡那霉素)选择压以及遗传转化过程中影响转化效率的5个主要因素(预培养时间、浸染时间、共培养温度、共培养时间和乙酰丁香酮浓度),得出30mgL-1的Kan浓度作为南方四季杨遗传转化过程中的选择压。高效遗传转化体系为:叶片预培养3 d;OD600=0.4的菌液浸染10 min～15 min;浸染前菌液中加入AS(乙酰丁香酮)300 umol·L-1;22℃～25℃条件下暗处共培养3d。     

矮牵牛遗传转化非洲商陆蛋白基因的研究

本文建立了矮牵牛的遗传转化体系，将非洲商陆蛋白基因转入矮牵牛，经PCR检测得到29个转非洲商陆蛋白基因株系。     

杨树对卡那霉素（Kanamycin）敏感性的测定

植物遗传转化时,选用抗性基因作为标记基因,用来分析已转化植株的基因整合及表达。新霉素磷酸转移酶基因(neo)是在遗传工程中经常使用的标记基因,它对卡那霉素具有很高的抗性。作为杨树基因转化的显性选择记号,首先要将杨树不同种对卡那霉素的敏感性进行测定。本文报道了这方面研究的结果。     

草坪草的遗传转化研究进展

概述了草坪草遗传转化的方法和发展趋势，重点介绍了草坪草的植株再生体系和草坪草的遗传转化方法的研究进展。通过愈伤组织培养，悬浮细胞培养，原生质体培养等手段，对早熟禾属，黑麦草属，结缕草属和剪股颖属的一些物种已建立了较为完善的植株再生体系。在这些再生体系的基础上，利用电激法，硅碳纤维法，PEG法和基因枪法在上述各属的一些物种上已成功地建立了遗传转化体系并获得了有一定应用前景的转基因植株。     

沙田柚高效转化体系建立初报

以沙田柚(Citrus grandis(L)Osbeck cv．)上胚轴为对象,农杆菌为载体,进行了抗菌肽shivaA基因转入沙田柚影响因素研究。研究结果表明,沙田柚上胚轴卡那霉素选择浓度为70mg／L,抑菌用抗菌素采用羧苄青霉素效果好于其它种类抗菌素。共培养期间,50mg／L羧苄青霉素的加入可促进转化频率的提高。实生苗苗龄以20～25天为宜。预培养3天、农杆菌再悬浮液与共培养基中加入3％烟草叶片提取液、选择剂起始浓度降为50mg／L有利于转化频率的提高。     

光皮树无性系ISSR-PCR反应体系的建立

以光皮树基因组DNA为材料,采用单因素实验,测试了退火温度、模板用量、dNTP浓度、Taq酶用量、Primer浓度、Buffer用量和Mg2+浓度等因素对ISSR-PCR的影响.优化的反应体系和条件:总体系为25 μL,引物0.2 μmol/L,模板20 ng、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶0.5 U、dNTP为0.1 mmol/L和Buffer为2.5 μL.扩增程序:94 C预变性5 min,1个循环;94 C变性50s,52 C退火1 min,72 C延伸1.5 min,40个循环;72C后延伸10min,1个循环.该体系的建立为今后利用ISSR进一步研究光皮树遗传连锁图谱构建、遗传多样性、种质资源鉴定与和基因定位奠定了技术基础.     

香樟ISSR技术体系的建立及应用评价

采用正交设计进行香樟(Cinnamomum camphora)ISSR分析技术体系的优化试验,结果发现其最佳体系如下:总反应体积20μL,1IPCR Buffer,2.5 mmol/L MgCl_2,200 nmol/L引物,150 μmol/L dNTPs,30 ng模板,0.5UTaq酶.应用上述优化的ISSR体系,对香樟变异种金叶红樟进行检测,结果表明:与其它野生型材料相比,2个变异类型样品均有独特的扩增条带出现,说明所建立的ISSR技术体系用于香樟不同遗传材料的遗传差异检测是有效的.