思茅松等位酶实验方法及改进

以思茅松种子的胚乳为实验材料,探索了思茅松等位酶的实验方法.采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳与水平切片淀粉凝胶电泳相结合的方法,获得所试验的13种等位酶中AAT,ADH,EST,GDH,G6PD,MDH,PGD6,PGM和SKD等9种电泳效果良好的等位酶酶谱.通过两种电泳方法的有机结合,以及对制样及上样方法的改进,大大地提高了实验效率.本研究得到的等位酶酶谱式样,为下一步思茅松种群遗传分析提供了资料.     

思茅松等位酶实验方法及改进

以思茅松种子的胚乳为实验材料，探索了思茅松等位酶的实验方法。采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳与水平切片淀粉凝胶电泳相结合的方法，获得所试验的13种等位酶中AAT，ADH，EST，GDH，G6PD，MDH，PGD-6，PGM和SKD等9种电泳效果良好的等位酶酶谱。通过两种电泳方法的有机结合，以及对制样及上样方法的改进，大大地提高了实验效率。本研究得到的等位酶酶谱式样，为下一步思茅松种群遗传分析提供了资料。     

杉木9个酶系统同工酶位点的遗传与连锁

采用淀粉凝胶水平板状电泳法,研究了杉木(Cunninghamia lanceolata Hook.)9个酶系统的遗传变异。LAP、PGM及SOD这3个酶系统是单态的,而GDH、GOT、TDH、MDH、6PGDH及SKDH这6个酶系统都是多态的。除MDH外,其余多态性酶系统按孟德尔方式遗传。43种双位点组合中,有7对位点间的连锁达极显著或显著水平。     

用叶同功酶鉴定柿的品种栽培

<正> 英国科学家借助淀粉凝胶泳法分析了柿子的163个栽培品种及柿属其它6个种的叶浸出物,从而鉴别磷酸葡糖异物酶(GPI,导电性为5、3、1、9)和苹果脱酸酸(MDH,导电性为1、1.1、37)的同功酶差异。随着两个酶系统的不同,谱带也急剧地变化,而且分辨得很清楚,没有栽培品种内的多型现     

油松天然群体种子、球果形态及同功酶遗传变异研究

对5种油松天然群体同功酶的研究表明：1）5种群体在GOT，ADH，SDH，MDH的分析中均有不同的谱带表现；在ME分析中所有的单株中均有1条清晰的谱带，属于1个染色区，受1个位点控制，该位点只有1个等位基因，属单态位点。2）5种群体在7个位点的等位基因频率和平均期望杂合度在不同酶位点间存在着较大的异质性。3）群体间的遗传分化主要来自群体内个体间，平均占总群体的95．02％。     

基于马尾松干旱转录组的抗旱功能SSR位点分析

[目的]了解马尾松干旱胁迫转录组序列的功能分布和SSR位点分布特征,并探索与干旱关联的SSR位点。[方法]对马尾松幼苗进行持续干旱胁迫,选取干旱10、15、25 d及正常供水对照的马尾松针叶样品,通过总RNA提取、Illumina测序、raw reads去冗、Trinity拼接获得unigenes。利用Blast比对,对Unigene序列进行GO、KOG、KEGG功能注释及分类;利用Misa软件进行SSR位点批量搜寻,primer 3. 0软件进行规模化SSR引物设计;利用GOSeq(1. 10. 0)、KOBAS(v2. 0. 12)软件对差异表达的含SSR位点Unigene进行GO、KEGG显著性富集分析。[结果]马尾松转录组194 821个Unigene中,101 806个Unigene获得注释,包含64 943个GO功能注释、35 880个KOG功能注释及30 882个KEGG注释。搜寻到6 728个SSR位点,分布于6 367个Unigene中,SSR出现频率为3. 45%;重复类型以单、三、二核苷酸为主,分别占总SSR的35. 82%、33. 03%和25. 22%;重复基序以A/T、AT/AT、AG/CT、AGC/CTG、AAG/CTT为主;基序长度以10 20 bp的短序列SSR为主;基序重复次数以5～10次重复占优势;批量设计13 338对SSR引物。422个含SSR位点Unigene具有差异表达; KEGG富集分析发现,有11个含SSR位点的差异Unigene参与了光合作用、植物激素信号传导及类胡萝卜素合成等3个与干旱响应相关的代谢途径。[结论]从较高质量的马尾松转录组中获得101 806个具有注释的Unigene;从6 367个Unigene中挖掘出6 728个SSR位点; 422个含SSR位点的差异表达Unigene中筛选出11个与干旱关联的SSR功能位点,为抗旱功能基因定位及马尾松抗旱分子机制研究奠定基础。     

毛红椿AFLP体系优化及引物筛选

以江西九连山国家级自然保护区毛红椿天然林为研究材料,对毛红椿AFLP反应体系中的DNA提取方法、酶切与连接步骤、连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等影响因子进行优化,并筛选AFLP多态性高的引物。结果表明：不同提取方法对DNA质量有很大影响,试剂盒法提取的DNA杂质少,质量高;酶切与连接采用一步法完成;连接产物最适稀释倍数为3倍,预扩增产物最适稀释为10倍;利用4个天然居群的毛红椿基因组DNA从64对引物组合中筛选出4对具有多态性扩增条带的引物,总扩增出147个位点,其中多态性位点122个,平均多态位点百分率84.36%,多态性较高,适用于毛红椿AFLP分析的4对引物组合分别是：E1/M6、E4/M7、E5/M3、E5/M8,为毛红椿遗传多样性和种质资源研究奠定了基础。     

福建油杉速生优树家系3地优选

珍贵树种家系测试优选是营建母树林的基础工作。为筛选油杉适生区域,推广油杉造林,分别在以1#、4#、6#、7#、27#等5个油杉家系为对象,在福建大田梅林、永春碧卿、华安西陂3个林场营建子代测试验林,通过8 a龄单株材积选择速生家系。结果表明,3县最优家系各异,梅林、碧卿最优家系均为4#、6#、7#、27#家系;西坡5个家系速生性能相近,所选家系可用于营建母树林,满足相应邻近地区油杉造林用种需求。     

基于苦楝转录组测序的SSR分子标记开发

【目的】基于转录组测序数据开发苦楝SSR标记,为苦楝种质资源的选育、评价和遗传改良提供理论基础和科学依据。【方法】利用Illumina Hi Seq~(TM)2500平台对苦楝叶片进行高通量测序,分别利用Trinity、MISA软件对转录组数据进行拼接组装、序列检索及SSR分布类型和特征分析。采用Primer 3软件设计合成100对SSR引物,分别用2%琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳进行初步筛选和多态性筛选。【结果】共获得Unigenes 20 077条,平均长度为1 431.82 bp,N50为1 955 bp;对Unigenes进行SSR位点的发掘和分析,发现4 116条Unigenes序列中含有5 469个SSR位点,SSR的发生频率为20.50%,平均分布距离为8.74 kb;单、二、三核苷酸重复单元分别占总SSR的50.23%、24.43%和22.11%; SSR重复单元以6～10次重复的最多,占总数的51.27%。筛选出16对多态性引物并进行PCR扩增,共检测到56个等位基因片段,平均每个位点含3.5个,平均有效等位基因数为2.31个,平均Shannon多样性指数I为0.861,平均多态性信息含量PIC为0.507。【结论】苦楝转录组SSR位点具有较高的出现频率和分布密度,基元类型和重复次数相对较高,具有高多态性的潜能,可以进行有目的的引物设计和开发。开发的16对SSR引物在苦楝上可检测到较高的多态信息含量,进一步丰富了楝科现有SSR标记数据库资源,可为楝科植物在基因组水平上的遗传多样性分析和分子辅助育种等提供参考。     

杉木叶绿体微卫星及其单倍型变异分析

杉木是我国南方重要的用材林树种,但其分子标记开发滞后于其他树种。文章利用种（属、科）间扩增法,从来源于黑松、日本柳杉等的21个叶绿体微卫星（SSR）位点中为杉木筛选适合的标记。结果表明:候选标记位点中有10个能够成功扩增,其中2个位点（CJCP1m₀04和CJCP2m₀02）具有多态性,其单倍型数量（A）分别为2和6,多样性指数（H）为0.233和0.733。多态性位点的单倍型序列分析结果表明,源于日本柳杉的CJCP2m₀02在杉木中属高变异位点,其SSR重复单元类型为（AT）n··（T）n,不同于来源物种的重复单元类型（AT）n。筛选得到的叶绿体微卫星（SSR）标记在杉木分子遗传学研究中具有重要用途。     

花楸树天然群体的异交率

采用水平淀粉凝胶电泳技术,对采自山东、山西、河北、辽宁4个省的6个花楸树天然群体的种子样本进行分析,所用同工酶多态位点分别为Pgm-1,Pgm-2,Pgm-3,Pgi-1,Pgi-2,Pgd-1,Pgd-2,Pgd-3,利用多位点异交率估算程序(MLT)估算6个群体的异交率.结果表明:花楸树各群体的花粉库与胚珠库中,各位点基因的配子比例差异不显著,基本处于平衡状态;各群体多位点异交率均在0.981以上,多位点异交率与单位点异交率平均值的差值(t_m-t_s)显示出花楸树各群体都存在轻度的自交或近交,说明花楸树属于混合交配类型,表现为高度异交.根据电泳数据计算的近交衰退δ=1,表明花楸树天然群体的近交衰退很大.     

基于转录组序列的楠木SSR分子标记开发

【目的】通过对楠木转录组数据的分析,开发楠木SSR分子标记技术,为楠木遗传多样性分析和资源保护提供保障。【方法】将楠木高通量转录组测序获得的67 331条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性。【结果】通过软件分析,共获得9 405个SSR位点,出现频率为13.97%,涉及序列数量为6 667条,发生频率为9.90%。SSR序列中包括166种重复基元类型,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为3 890(41.36%),2 885(30.68%),2 489(26.46%)。SSR位点重复次数差别较大,其中重复10次比例最高,SSR位点数为1 621(17.24%),其次是5次(1 549,16.47%)和6次(1 495,15.90%)。主导重复基元类型为A/T(40.67%),AG/CT(27.59%),AAG/CTT(11.29%)。运用多态性分析的方式初步验证了SSR位点在楠木标记中的可行性。同时,利用Primer 3.0进行引物设计,随机筛选18对进行验证,9对引物可以扩增出预期大小的条带。【结论】通过对楠木高通量转录组序列的SSR信息的研究,获得6 667条SSR序列,主导重复类型为A/T,AG/CT和AAG/CTT。同时随机挑选18对引物对SSR分子标记方法进行验证。本文对楠木SSR标记的研究将有助于楠木基因挖掘、分子标记育种和资源保护。     

黄藤2个NAC基因的分子特征及其SSR分子标记开发

【目的】棕榈藤是重要的森林植物,纤鞭是其重要的攀援器官,也是重要的分类依据。研究黄藤NAC(NAM,ATAF和CUC)转录因子基因的分子特征并开发SSR分子标记,以期为棕榈藤的分子育种和辅助分类提供参考依据。【方法】以黄藤为材料,借助转录组数据,采用同源克隆的方法从黄藤中分离NAC基因,采用生物信息学方法进行基因结构、蛋白性质与结构分析和SSR位点预测,采用实时定量PCR技术分析基因的组织表达特性,利用PAGE电泳和测序技术分析SSR分子标记在不同棕榈藤样品中的通用性和多态性。【结果】从黄藤叶片中获得了2个NAC同源基因DjNAC3(Gen Bank登录号:KU556738)和DjNAC4(Gen Bank登录号:KX579750),二者的开放阅读框长度分别为729 bp和1 326 bp,对应的基因组序列为850 bp和1 441 bp,均包含2个外显子和1个内含子。DjNAC3和DjNAC4编码的蛋白分别为242 aa和441 aa。蛋白结构分析表明,DjNAC3和DjNAC4具有典型的NAC转录因子结构特征,属于NAC家族的CUC亚家族,但二者之间的相似系数仅为23.6%,表明它们在黄藤生长发育过程中可能具有不同的功能。DjNAC3和DjNAC4在不同组织中的表达模式存在明显差异,DjNAC3在发育成熟纤鞭中的表达丰度最高,叶片中的表达丰度最低,而DjNAC4则在发育成熟的钩刺中表达丰度最高,而发育初期的钩刺中最低。在DjNAC3和DjNAC4的基因组序列中分别包含1个SSR位点,其中前者的SSR位点位于内含子区域,为(TA)6,后者的SSR位点位于第1个外显子区域,为(GCA)5。根据DjNAC3和DjNAC4中SSR位点旁侧序列设计引物,以黄藤和另外20个不同棕榈藤样品的基因组DNA为模板进行扩增,PAGE电泳结果分析表明,引物具有较高的通用性,且扩增产物具有多态性。6个样品的测序结果证实,用DjNAC3设计引物的扩增产物测序获得的SSR位点序列存在着一定的差异,既包括SSR类型变异、重复次数变化等多态性,又有SSR位点缺失的现象;而根据DjNAC4设计引物扩增获得的SSR位点序列差异主要为重复次数的变化。【结论】黄藤DjNAC3和DjNAC4基因的基因结构、表达模式、SSR位点等均存在明显的差异,这表明它们在黄藤生长发育中可能具有不同的功能,二者所包含的SSR分子标记具有通用性和多态性,可以作为分子标记应用于棕榈藤的辅助分类和分子辅助育种。     

偏肿革裥菌锰过氧化物酶的分级纯化

【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)锰过氧化物酶(MnP)的分级纯化,以期得到L.gibbosa MnP的纯品和进行后续酶学性质研究。【方法】在对L.gibbosa所产MnPs进行优化培养、获得大量MnPs粗酶液的基础上,通过硫酸铵(NH4)2SO4分级盐析、聚乙二醇(PEG)沉淀进行粗酶液浓缩、在起始缓冲液中进行透析、经DEAE-琼脂糖CL-6B离子交换柱层析进行梯度洗脱和葡聚糖G-75凝胶过滤柱层析等方法对MnPs粗酶液进行纯化,并对分级纯化方法进行优化,对纯化浓缩后的纯酶样品采用SDS-PAGE方法进行酶纯度检验。【结果】在75%、80%和85%这3种(NH_4)_2SO_4饱和度中,85%的(NH_4)_2SO_4是沉淀MnPs的适宜饱和度,在该饱和度下测得上清液中酶活为3.63 U·L~(-1),蛋白浓度为0.132 mg·mL~(-1),表明MnPs已基本沉淀完全;试管小试法确定离子交换柱层析中上样的最适缓冲体系为pH7的Na_2HPO_4-NaH_2PO_4起始缓冲液;离子交换柱层析后收集的洗脱液检测到3个蛋白吸收峰,其中只在第2个蛋白吸收峰中检测出MnP活性,该MnP活性值变化曲线与蛋白吸光值一致。这个活性峰经凝胶过滤柱层析后,洗脱结果只出现1个明显的蛋白吸收峰,在其中检测出较高的MnP活性;浓缩后的冻干样品经SDS-PAGE电泳检测只在约40 k Da处有1条清晰的蛋白谱带,表明对MnP的纯化已达到电泳纯。【结论】筛选出85%饱和度的(NH_4)2_SO_4盐析法是初期沉淀与纯化L.gibbosa所产MnPs的最适方法;PEG浓缩法简便、易行、有效;初期浓缩后再经过离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析可以得到电泳纯的MnP纯化样品。     

胡杨根、茎、叶、愈伤组织总RNA提取的研究

胡杨根、茎、叶、愈伤组织等器官和组织的总RNA高质量提取是进行以胡杨RNA为基础的分子生物学研究的基础。以2 a生胡杨实生苗根系为材料,用CTAB-PVP提取缓冲液裂解细胞并变性蛋白,经氯仿/异戊醇(24∶1,v/v)抽提后,用3种不同的沉淀方法获得胡杨根系总RNA,电泳和定量测试等分析提取质量。结果表明,LiCl沉淀法结合70%乙醇洗涤沉淀两次获得的的胡杨根系总RNA,条带清晰、亮度高,且没有明显的DNA污染;actin基因片段设计引物对胡杨根系总RNA进行RT-PCR扩增,扩增片段与预期大小一致,表明该RNA可用于逆转录合成cDNA,提取物RNA中的Li 残留对逆转录酶活性的抑制作用不明显;该方法用以提取2 a生胡杨实生苗茎、叶及愈伤组织总RNA,均获得高质量总RNA。CTAB-PVP-LiCl(附70%乙醇洗涤RNA沉淀2次)的方法可用于胡杨根、茎、叶和愈伤组织总RNA的提取。     

PCR法克隆紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶全长cDNA

4 香豆酸 :CoA连接酶 (4CL)是木质素生物合成过程中重要的酶 .该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法直接获得了紫穗槐 4CLAcDNA全长序列 ,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程 .先用简并PCR得到了 4CLA1片段 ,又据此片段设计反向嵌套引物 ,用RACE方法获得未知的 5′和 3′端序列 .所获得的全长 4CLAcDNA ,编码 5 40个氨基酸 .氨基酸序列同源性分析表明4CLA是典型的 4CL蛋白 ,含有预计的AMP binding位点、催化反应区和保守的Cys .     

短枝木麻黄无性系鉴定及其指纹图谱构建

[目的]构建木麻黄无性系的DNA指纹图谱鉴定体系,为今后短枝木麻黄的品种鉴定、品种权保护、新品种的选育提供依据。[方法]从71对EST-SSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好、扩增稳定的12对引物,采用降落PCR和毛细管电泳的基因分型方法,以采集的9个短枝木麻黄标准无性系的基因分型结果为参照,对华南沿海地区采集的109个短枝木麻黄无性系单株进行鉴定,并结合引物组合法构建基于EST-SSR分子标记的短枝木麻黄无性系鉴定体系。[结果]12对EST-SSR引物对109个短枝木麻黄无性系单株进行PCR扩增,共检测到50个等位基因,每个位点的等位基因数为3～6个,平均为4.2个,每对引物可区分2～5个短枝木麻黄无性系。根据鉴定结果,最终所有样品被划分为22个无性系,除已知的9个标准无性系外,另有13个无性系为不知名无性系,说明不同地区的无性系存在重复命名现象;利用引物组合法进一步优化后,发现只需7对引物就可将22个短枝木麻黄无性系完全区分,并依此建立了基于7对EST-SSR引物的22个短枝木麻黄无性系的指纹图谱,每个无性系都获得了一个7位数的指纹图谱编码。[结论]利用7对EST-SSR引物构建的22个短枝木麻黄无性系的DNA指纹图谱可用于短枝木麻黄无性系的鉴别,研究表明,华南沿海地区部分短枝木麻黄无性系存在命名混乱、同物异名、无性系数量少的现象,新品种选育工作亟待开展和加强。     

基于CE-AFLP的5个美洲黑杨新品种指纹图谱分析

以5个美洲黑杨新品种(丹红杨、南杨、中林2025杨、中红杨和全红杨)为实验材料,利用CE-AFLP(毛细管电泳-AFLP)技术,采用EcoR I+3/Mse I+3和Pst I+2/Mse I+3引物组合构建指纹图谱,并进行遗传多样性分析.结果表明:从36对引物组合中筛选出12对扩增条带数目多、稳定且清晰的引物进行扩增,共获得条带数877条,多态性条带数315条,平均多态率为35.92％.采用UPGMA法进行聚类分析,相似系数为0.74～1.00;丹红杨与南杨之间的差异较大;在相似系数0.98时,中林2025杨与中红杨和全红杨分为两类,11条稳定特异的条带可以作为鉴别它们的依据;全红杨和中红杨之间未监测到稳定清晰的特异条带,初步认为2个品种在基因组水平上没有明显差异.     

欧洲榛微卫星对我国榛属种质资源的分析

利用多态性高、重复性好的11对欧洲榛微卫星引物对榛属6个近缘种的34个DNA样本进行扩增,共获得81个等位基因,每个座位的等位基因数在4～13之间,平均数目为7.36个,位点的多态信息含量(PIC)介于0.47～0.86,平均为0.73.PCR扩增产物的DNA测序证明欧洲榛SSR基因座位中微卫星序列在6个种内的保守性,而在CAC C28位点,一个被忽略的短三碱基重复序列也表现出长度多态性.另外,对于具有商业潜力的平榛、毛榛、川榛3个种的遗传多样性分析表明,平榛的遗传多样性最高,为0.59.研究结果表明欧洲榛微卫星是用于榛属资源保护、品种改良以及种问遗传图谱构建的有力工具.     

泡桐属植物亲缘关系的ISSR分析

利用ISSR分子标记对泡桐属21份种、变种及变型材料进行亲缘关系分析。结果表明:从100个ISSR引物中筛选出9个扩增产物电泳后带型清晰可辨的引物,共扩增出85条DNA片段,其中多态性带74条,多态位点百分率为87.05%,反映出泡桐属不同种质间遗传差异明显,其丰富的多态性与供试材料广泛的种质代表性有关;UPGMA法将研究材料分成毛泡桐组、白花泡桐组和川泡桐组3大组,地理分布较近的种质聚类在一起,表现出较密切的亲缘关系;在对兰考泡桐、山明泡桐、白花兰考泡桐、楸叶泡桐、圆冠泡桐、亮叶毛泡桐、毛泡桐、白花泡桐、川泡桐的亲缘关系分析及分类处理上,基本上与形态学、细胞学、同工酶的研究结果一致。最后对泡桐属的部分植物的分类问题进行讨论。同时发现部分泡桐的一些特异性条带,可以进一步转化为SCAR标记。