产苦马豆素疯草内生真菌及苦马豆素研究进展

疯草(Locoweed)是黄芪属、棘豆属和苦马豆属中含苦马豆素(swainsonine, SW)有毒植物的统称,具有抗旱耐寒,分布广泛的特性。牲畜长期采食疯草会引起蓄积性中毒,严重时导致死亡,严重危害了我国草原畜牧业的可持续发展。疯草内生真菌是疯草具有毒性的根本原因,其毒性代谢产物即苦马豆素。论文对疯草在中国的种类与分布、疯草与内生真菌互作关系、疯草内生真菌种属及检测方法、疯草内生真菌传播方式与内生真菌育种;苦马豆素的来源、毒理机制及生物合成通路最新研究进展做一综述,以期为疯草植株及其内生真菌的改造利用方面提供参考。     

变异黄芪中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定

从变异黄芪种子中分离并纯化内生真菌,应用ɑ-甘露糖苷酶抑制法检测能产生苦马豆素的内生真菌。提取真菌DNA,扩增和测定真菌ITS和GPD序列,进行序列同源性比较,构建系统发育树。结果:从变异黄芪种子中共分离到3株产苦马豆素内生真菌,其形态特征均与波状芽管蠕孢属相近;ITS和GPD序列与棘豆波状芽管蠕孢一致性高达99%;遗传分析显示,3株菌与棘豆波状芽管蠕孢真菌遗传距离最近。根据形态特点和遗传进化分析结果,将该3株菌鉴定为棘豆波状芽管蠕孢。     

波状芽管蠕孢属疯草内生真菌研究进展

疯草是世界范围分布的豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的统称,其主要毒性成分为吲哚里西啶类生物碱——苦马豆素。放牧家畜采食疯草会发生疯草中毒病,导致瘫痪、不孕、流产、生产性能下降、死亡等,造成的经济损失巨大。波状芽管蠕孢菌是疯草中普遍存在的一类内生真菌,该菌与疯草中苦马豆素的合成和疯草的毒性紧密相关。抑制或阻断波状芽管蠕孢菌在疯草中的传播和苦马豆素合成,将有望降低或消除疯草的毒性。本文将对波状芽管蠕孢属疯草内生真菌的种属分类、与疯草毒性的关系、传播机制、SW的合成机理等方面的研究进行综述,为疯草内生真菌相关研究的开展和从控制疯草内生真菌角度防控动物疯草中毒病提供思路。     

疯草—内生真菌共生体的研究与展望

就近年来国外对疯草内生真菌的分离、宿主植物体内生真菌分布、疯草苦马豆素种群分布特征及其与内生真菌的相关性研究进展作一综述，以期更好地利用疯草及内生真菌造福人类。     

疯草内生真菌苦马豆素合成相关基因及其研究方法的进展

<正>豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物统称为疯草。疯草的营养价值丰富,是潜在的优良牧草。但家畜长期或过量采食后,可发生以神经机能紊乱为特征的慢性中毒病,称之为疯草中毒病[1]。中毒家畜表现为共济失调、瘫痪、流产、不孕、出生缺陷和死亡等。疯草导致动物中毒的主要因素是疯草中的吲哚里西啶类生物碱—苦马豆素,它能特异性地抑制参与糖蛋白分解代谢的溶酶体α-甘露糖苷酶、高尔基α-甘露糖苷酶Ⅱ,破坏细胞内膜系统[2-     

棘豆属植物中产苦马豆素内生真菌的研究进展

苦马豆素(SW)是棘豆属(Oxytropis)植物引起家畜中毒的主要原因,而苦马豆素的产生与棘豆属植物的内生真菌有关。目前,棘豆属植物中能够产生苦马豆素的内生真菌不断被发现,所以文章对产苦马豆素内生真菌的寄主植物、形态、培养条件及其与苦马豆素的关系、对寄主植物的影响等进行了综述,为棘豆属植物的有效利用及家畜中毒的防治提供理论依据。     

疯草内生真菌研究进展

疯草含有疯草毒素,动物采食后能引起以慢性神经机能紊乱为特征的中毒病,是世界范围内危害草原畜牧业最严重的毒草之一.对疯草主要有毒成分苦马豆素来源问题的研究发现,疯草内生真菌与苦马豆素之间具有极为密切的关系.近年来,科研工作者对多种疯草的内生真菌进行分离,并对其与疯草的相互关系进行了深入研究.论文主要介绍了近年来国内外有关...     

产苦马豆素疯草内生真菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据疯草内生真菌苦马豆素合成基因簇中swn K 基因KS 区域设计引物,构建SYGR Green I实时荧光定量PCR检测方法,初步分析黄花棘豆植物样品中内生真菌生物量与苦马豆素含量的关系.结果表明,基于swnK基因KS区域构建的实时荧光定量PCR法特异性较好,灵敏性较高,当真菌起始DNA浓度在0.009?90ng/μ...     

疯草-内生真菌共生体的研究与展望

就近年来国外对疯草内生真菌的分离、宿主植物体内生真菌分布、疯草苦马豆素种群分布特征及其与内生真菌的相关性研究进展作一综述,以期更好地利用疯草及内生真菌造福人类。     

小花棘豆产苦马豆素内生真菌的筛选与鉴定

通过对小花棘豆内生真菌的分离纯化,筛选产苦马豆素内生真菌,探讨小花棘豆内生真菌与其毒性成分苦马豆素的相互关系。本研究对采自内蒙古西部草地的6份小花棘豆样品进行内生真菌分离纯化,采用薄层色谱和气相色谱技术对内生真菌发酵液进行苦马豆素定性、定量检测,筛选产苦马豆素内生真菌;结合形态学和分子生物学方法进行内生真菌种属鉴定。从小花棘豆样品中分离得到6株内生真菌。经筛选,其中有2株产苦马豆素,编号为XJ-J-I和XJ-H-1,其发酵液中苦马豆素产量分别为4.209 2mg.L-1和16.733 8mg.L-1。鉴定结果表明,这2株内生真菌虽然形态学存在差异,但基因型相同,同属镰刀属内生真菌—层出镰刀菌(Fusarium prolifera-tum)。小花棘豆中存在产苦马豆素内生真菌。     

产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis的发酵培养及苦马豆素检测方法的建立

通过对生长初期疯草内生真菌U.oxytropis菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法对菌丝、发酵液中SW含量进行测定。结果显示,经测定疯草内生真菌U.oxytropis菌丝干重质量,确定疯草内生真菌U.oxytropis生长周期为24d;薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法都可快速对菌丝和发酵液中提取的SW进行定性、定量检测,并比较3种检测方法,发现气相色谱法检测限低、灵敏度更高。本试验完成了疯草内生真菌U.oxytropis生长周期的测定,并建立了菌丝、发酵液中SW的有效、快速提取及检测方法,为下一步产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis生物合成机理的研究奠定基础。     

宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离及鉴定

对宁夏黄花棘豆中产苦马豆素内生真菌进行分离和鉴定,为进一步研究疯草内生真菌合成苦马豆素的分子调控机理提供菌种和奠定基础。分离并纯化黄花棘豆植物组织中的真菌,采用气相色谱质谱联用法对各菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能产生苦马豆素的内生真菌;紫外线照射和黑暗交替培养诱导内生真菌产孢;提取真菌DNA,扩增和测定真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD）、内部转录间隔区（internal transcribed space,ITS）和线粒体核糖体小亚基（mitochondrial small subunit,mt SSU）基因序列,进行同源性比对和遗传进化分析,对其进行种属分类和命名。本研究从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌,其中菌株NX-FEL001菌丝中含有苦马豆素,经诱导培养,该菌株能产生分生孢子及分生孢子梗等结构;序列同源性和系统发育分析结果表明,该菌株与Undifilum真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析结果将菌株NX-FEL001鉴定为Undifilum oxytropis。     

产苦马豆素真菌的筛选与鉴定

为探明青海及内蒙古多种疯草类植物及其根际土壤中是否存在产生苦马豆素的真菌,并对其种属进行鉴定,同时测定其苦马豆素产率。本试验拟对采自内蒙古和青海的疯草样品中的内生真菌及根际土壤真菌进行分离;应用薄层色谱和气相色谱法分别检测菌丝及发酵液中苦马豆素含量,筛选可产生苦马豆素的真菌;运用形态学和分子生物学方法对其属种进行鉴定。从青海采集的疯草样品中分离并筛选出2株可产苦马豆素真菌,一株为土壤真菌,一株为内生真菌,分别命名为FS-5和EFG-7;菌丝中苦马豆素含量分别为0.773和0.11 mg.g-1,结合形态学和分子生物学试验结果,确定这2株真菌分别为裂褶菌属真菌和镰孢菌(霉)属三线镰刀菌。结果显示,我国青海疯草及根际土壤中存在可产生苦马豆素的真菌。     

疯草内生真菌研究现状与存在问题

疯草是世界范围内危害草原畜牧业可持续发展最严重的毒草。引起家畜疯草中毒的主要成分是吲哚里西啶生物碱--苦马豆素,苦马豆素除具有毒性外,还具有显著的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫等药理活性,有关苦马豆素产生机制、毒理和药理活性研究已成为人们研究的热点。为了揭示疯草毒性物质产生机制、疯草内生真菌与疯草抗逆性,特别是疯草毒性物质与疯草内生真菌互作关系等诸多问题,国内外科技工作者从20世纪末就开始致力于疯草内生真菌生物多样性、疯草内生真菌与苦马豆素产生关系以及与疯草抗逆性形成机制研究,已从多种疯草中分离到可产苦马豆素的内生真菌,并发现疯草内生真菌与疯草之间存在密切关系。本文对近年来国内外疯草内生真菌研究的主要内容及研究现状进行综述,并对该研究领域中存在的若干问题进行了探讨。     

生物降解对疯草营养成分与苦马豆素含量影响的研究

为研究生物发酵降解对疯草营养成分与苦马豆素含量的影响,采用混合青贮技术对疯草类有毒植物变异黄芪有毒成分苦马豆素进行生物降解处理,测定降解处理前后变异黄芪营养成分及苦马豆素含量变化情况。结果表明,变异黄芪经生物降解处理后其营养成分变化较小,而苦马豆素含量平均下降了78.09%。该处理方法简单经济、毒素降解高效,适宜在我国疯草威胁区域推广。     

苦马豆素对SD大鼠血液学指标的影响

将64只雌性SD大鼠随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,每组16只.试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂含甘肃棘豆干草粉15％(含苦马豆素0.03‰)、30％(含苦马豆素0.06‰)、45％(含苦马豆素0.09‰)的全价饲料,对照组饲喂全价饲料.试验期间,每天观察受试大鼠的临床表现,每周测定体质量1次.在攻毒5、9、13、17周后采血,运用全自动血液细胞分析仪测定各组大鼠血液WBC、LYM、MO、NE、RBC、HGB、HCT、MCV、RDW、PLT及MPV的变化.结果显示,与对照组相比,试验组WBC、MO、NE、RDW、MPV升高,LYM、RBC、HGB、HCT降低,MCV先降低后升高,PLT先升高后降低,部分组间差异显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01).结果表明,长期低剂量摄食苦马豆素可诱发SD大鼠贫血,但可提高机体免疫力和骨髓造血能力.     

苦马豆素研究最新进展

疯草(locoweed)是豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的统称,其主要毒性成分是苦马豆素,动物采食后发生慢性神经机能障碍性中毒病,每年给牧区造成巨大的经济损失。另外,苦马豆素因其具有毒性和药理活性双重作用,受到毒理学界和医学界的普遍重视。本文不仅对苦马豆素毒性及作用机制、药理活性、来源和苦马豆素生物合成通路的最新研究进展进行了综述,而且还对合成通路中可能涉及的调控酶进行了推测。同时,又对未来苦马豆素的研究进行了展望,以期为疯草中毒病的防治提供参考。     

野生型斜茎黄芪内生真菌分离鉴定及苦马豆素分析

为探明青海野生型斜茎黄芪(Astragalus adsurgens)是否存在产苦马豆素内生真菌,本试验采用植物组织表面消毒法对斜茎黄芪内生真菌进行分离培养,运用形态学观察和内部转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列分析鉴定分离获得的内生真菌种属,并构建系统发育树,应用薄层层析法对斜茎黄芪和优势菌发酵液中的苦马豆素进行检测。结果显示,从斜茎黄芪中共分离出26株菌株,分属于5纲、5目、7科、7属,4株未定属。其中由根中分离的链格孢菌属(Alternaria sp.)是斜茎黄芪的优势菌属,分离率为23.08%。从薄层层析结果可以看出,斜茎黄芪和优势菌发酵液中均未检测到苦马豆素。上述结果表明,野生型斜茎黄芪不属于疯草类有毒植物,这为该植物的后续资源化利用提供重要理论依据。     

内蒙古不同小花棘豆种群苦马豆素及其内生真菌关系的分析

小花棘豆是广泛分布于内蒙古草原和荒漠区的一种有毒植物,其主要毒性成分为有毒生物碱——苦马豆素（swainsonine,SW）,牲畜采食后可引起中毒,甚至死亡,给当地畜牧业造成重大经济损失。本研究旨在探究内蒙古不同小花棘豆种群植株苦马豆素及其与内生真菌关系。采集内蒙古8个样地120株小花棘豆,利用萃取、离心、离子交换层析法提取和纯化植物单株和菌丝体的SW,用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）检测SW水平,取茎和叶外植体分离培养内生真菌,提取植物和真菌的总DNA,扩增真菌特异序列,利用内生真菌微生物学特征和DNA序列比对进行鉴定。结果显示：8个种群共111株小花棘豆检测出SW,最高水平为369.05 μg·g^-1,平均水平32.78 μg·g^-1,从38株小花棘豆分离培养出内生真菌,纯培养下菌丝体呈松散白色绒毛状,菌落圆形、隆起、边缘整齐、辐射状生长,颜色逐渐呈现灰色、深灰色或褐色至深褐色,内生真菌均测出SW,其水平为0.83~2 573.24 μg·g^-1,经微生物学研究及5.8S rDNA/ITS序列比对分析,在属水平上鉴定该内生真菌为Alternaria。有Alternaria内生真菌的小花棘豆植株含SW,无该内生真菌的植株不含SW,培养的Alternaria内生真菌合成了SW。     

甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定

4.5kg甘肃棘豆用 2 0mL/L稀乙酸和氯仿的混合溶液 (5∶4)浸提 48h,过滤 ,分层。取酸水层用氯仿萃取 ,弃去氯仿层以除杂质 ,然后酸水层用氢氧化钠调pH为 9～1 1 ,依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇部分经硅胶柱层析 ,氯仿∶甲醇∶氨水∶水 (70∶2 6∶1 0∶1 0 )液洗脱分离、纯化得到一白色针状结晶体 ,TLC鉴定分析初步确定为苦马豆素 ,提取率为3 .2 0 μg/g。正丁醇部分苦马豆素含量气相色谱测定为 1 3 .1 4 8%± 0 .852 % ,折算全草苦马豆素含量为 0 .0 69%。