口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。     

草莓镶脉病毒外壳蛋白的原核表达及多抗血清制备

PCR扩增得到了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的外壳蛋白(coat protein,cp)基因,将SVBV cp基因克隆到原核表达载体pET-32a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为0.05 mmol·L-1的IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳及Western-blot分析表明,SVBV cp基因在大肠杆菌中得到了融合表达。利用Ni2+-NTA亲和树脂纯化重组融合蛋白,免疫家兔获得了重组蛋白的多抗血清。以此多抗血清建立了Dot-ELISA检测方法,结果表明,制备的特异性多抗血清可以快速检测出感病草莓样品中的SVBV。     

非洲猪瘟病毒p30-54融合蛋白基因的构建、表达及其多克隆抗体制备

为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。     

H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为构建新型H7亚型禽流感HA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。从NCBI数据库下载H7亚型禽流感HA全基因序列,合成HA基因;定向克隆到原核表达载体p ET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-HA;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot法鉴定。结果显示,重组质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;重组的HA融合蛋白约为84 ku,大小与预期融合蛋白大小一致;重组HA融合蛋白可以与His标签单克隆抗体特异性结合,与H7阳性血清有较强的反应原性。成功构建了HA基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组HA融合蛋白表达。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得针对番鸭细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体,根据已发表的该病毒基因序列设计一对引物,利用PCR扩增出VP3基因,将其克隆到原核表达载体p ET-32a,转化感受态细胞BL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白。将重组蛋白切胶免疫BALB/c小鼠,制备抗番鸭细小病毒部分结构蛋白的多克隆抗体。结果显示成功获得VP3基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠获得的多克隆抗体能与番鸭细小病毒及VP3蛋白反应。表明制备的多克隆抗体可用于MDPV的检测,并为进一步研究MDPV奠定了基础。     

粪肠球菌Ace抗原表位预测及重组表位 疫苗载体构建与表达

利用生物信息学软件预测抗原表位,然后将筛选出的6个抗原表位基因片段分别与铁蛋白H亚基基因片段连接,并克隆到p ET-32a表达载体中,构建能融合表达Ace抗原表位和铁蛋白H亚基的重组质粒p ET-32aace1、p ET-32a-ace2、p ET-32a-ace3、p ET-32a-ace4、p ET-32a-ace5、p ET-32a-ace6,并经测序验证;优化诱导条件获得原核表达的重组蛋白后,用SDS-PAGE和Western Blot验证其相对分子质量大小和免疫原性;将重组蛋白进行纯化超滤,然后进行透射电镜成像检查。结果显示,本研究成功构建了7种原核表达载体;在IPTG诱导下获得了5种可溶性表达的融合蛋白,且均有较强的免疫原性;重组融合蛋白Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H在透射电镜下观察到了具有与天然铁蛋白类似的特殊中空结构,且其直径与天然铁蛋白纳米笼类似;而带多表位的重组蛋白Ace-H虽然也能自组装成纳米级颗粒,但没有中空核心,其直径也比天然铁蛋白略大。     

T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。     

T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。     

葡萄卷叶伴随病毒ⅢCP基因在E.coli中的表达

将葡萄卷叶伴随病毒 的 CP基因克隆到表达载体 p ET- 30 a中 ,转化大肠杆菌 BL2 1,筛选得到阳性克隆 GB- 1,用 IPTG诱导使其表达。SDS- PAGE电泳分析表明 ,该 CP基因在大肠杆菌 BL2 1中得到大量表达。用该病毒的 CP抗血清通过间接 EL ISA证明所表达的蛋白具有很好的抗原性     

香蕉线条病毒MP功能域基因的克隆、原核表达及抗血清制备

【目的】制备香蕉线条病毒广东分离物(BSV-GD)MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清,为BSV基因编码蛋白功能的研究提供条件.【方法】对BSV-GD ORF3基因氨基酸序列进行生物信息学分析,得出MP功能域基因序列,克隆该基因并插入载体pET-28b(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用超声波裂解法进行蛋白可溶性分析,利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的融合蛋白进行纯化和回收,然后以纯化的目的蛋白为抗原免疫健康家兔制备其多克隆抗血清;通过Western-blot分析该抗血清的特异性,间接ELISA法检测该抗血清的效价.【结果和结论】MP功能域基因在ORF3中的序列为61~311 aa处,核酸序列长753 bp.试验克隆了该基因并成功构建了其原核表达载体pET28b-MP,经IPTG诱导1 h后表达了相对分子质量约为30 800的融合蛋白6His·MP.可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在,纯化获得了高纯度的目的融合蛋白,以其为抗原成功制备了BSV-GD MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清;分析表明该抗血清具有很强的特异性,其效价高达204 800倍以上.     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及鉴定

[目的]使番鸭细小病毒(DPV)VP3在原核表达系统中正确表达.[方法]根据番鸭细小病毒VP3基因序列,设计一对特异性引物,利用PCR技术扩增出VP3基因;将其克隆至原核表达载体p ET-32a,获得重组表达载体p ET-32a-VP3.将重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白.[结果]成功表达出与预期大小相符的重组蛋白,约89 k Da;且当IPTG浓度为1.2 mmol/L,诱导时间为6 h时蛋白表达量最大.[结论]该研究通过原核表达系统成功表达了DPV、VP3蛋白,并摸索了蛋白最佳表达条件.     

ShSAP1的原核表达及多克隆抗体的制备

将ShSAP1的阅读框连接到原核表达载体p ET32a(+)中,构建成ShSAP1原核表达载体PET-ShSAP1,然后将其转入宿主菌BL21,经IPTG诱导后,宿主菌表达出与预期分子量大小相符的35 ku的融合蛋白;将纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了ShSAP1的特异性抗血清;以融合蛋白作抗原,用间接ELISA法测定其抗血清效价为1∶25 000。     

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p7的克隆和原核表达纯化

为了对牛病毒性腹泻病毒(BVDV) p7蛋白进行表达和纯化,本研究开展p7基因克隆、原核表达载体构建和原核表达分析。依据GenBank数据库中BVDV毒株NADL的p7基因设计引物,以BVDV NADL的cDNA为模版,PCR扩增p7基因,测序鉴定后将其克隆至pCold-MBP原核表达载体中;优化蛋白诱导的IPTG浓度,过夜低温诱导p7蛋白表达,并使用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化。结果显示,成功克隆p7基因,与GenBank数据库中p7基因同源性100%;成功构建pCold-MBP-p7载体;IPTG浓度为1.2mM时诱导效果最佳;成功表达和纯化MBP-p7融合蛋白。结论:诱导表达纯化获得MBP-p7融合蛋白,为后续构建p7蛋白的多克隆和单克隆抗体提供重要的材料和平台。     

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

华东葡萄抗逆相关基因VpSBP16原核表达及功能初步分析

SBP-box基因在植物响应逆境胁迫中起着非常重要的作用,通过制备华东葡萄(V.pseudoreticulata)转录因子VpSBP16基因抗血清,为深入探究葡萄抗逆相关基因VpSBP16的功能试验提供基础。将已构建的pGEX-VpSBP16原核表达载体转入大肠杆菌中,利用IPTG诱导表达的蛋白作为抗原注射新西兰兔,从而获得VpSBP16基因抗血清,利用Western blot检测手段,以所获得的VpSBP16基因抗血清作为一抗检测毛葡萄‘商-24’叶、茎、花序、卷须和果实不同发育时期的VpSBP16蛋白表达情况。结果表明,原核表达载体pGEX-VpSBP16在大肠杆菌菌株DE3中高效表达,Western blot检测出与预期结果一致的分子量约为87kD的GST-VpSBP16融合蛋白。在新西兰兔的背部及腹股沟注射纯化后的目的融合蛋白获得了免疫-抗原反应良的多克隆抗血清。提取葡萄总蛋白后检测到VpSBP16蛋白表达量在花序中含量最低,而在果实发育的绿果期表达量较高。大肠杆菌表达系统中,pGEX-VpSBP16融合蛋白可以在27℃、0.6 mmol/L IPTG诱导条件下获得高表达。因此...     

鸡氨肽酶N蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究

试验参考Gen Bank上鸡氨肽酶N(g APN)基因序列(登录号为NM_204861.1)设计多对特异性引物,利用RT-PCR分段克隆g APN基因各段克隆产物并利用SOE-PCR将其进行连接,得到大小为2 906 bp的全长基因。利用原核表达载体p ET-30a(+)构建重组质粒p ET-g APN并转化E.coli Rosetta,经诱导表达得到大小为113 ku目的条带。以纯化g APN重组蛋白为免疫原制备兔抗g APN多克隆抗体,间接Elisa方法检测多抗血清效价为215。Western Blot试验证明,此多克隆抗体可以与原核表达的蛋白产生特异性条带,同时与18日龄鸡肾组织中获得的天然g APN蛋白样品有良好的反应性。间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体可检测到pc DNA-g APN转染HELA细胞所表达的g APN蛋白。上述结果可为g APN蛋白的深入研究奠定基础。     

太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。     

牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究

为了检测重组蛋白SPAG11D的抑菌活性,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增了SPAG11D基因,将该基因插入p ET-32a(+)融合表达载体,并转入BL21(D3)进行原核表达,通过改变IPTG浓度和诱导时间优化表达条件,并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增牛SPAG11D基因,产物大小为390 bp,其序列与Gen Bank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体p ET-32a(+)-SPAG11D,重组蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间为4 h;表达产物的分子质量约为33 k Da;该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛SPAG11D基因的原核表达载体,并获得了具有抑菌活性的重组蛋白His-SPAG11D。