鸭疫里默氏杆菌KYF39＿09285基因缺失株的构建及生物学特性研究

为研究KYF39＿09285基因对鸭疫里默氏杆菌生物学特性及其对雏鸭致病力的影响，试验利用基因同源重组的原理构建KYF39＿09285的基因缺失株RA-YMΔKYF39＿09285，并使用穿梭质粒构建其基因回补菌株，评价其对鸭疫里默氏杆菌生物学特性以及雏鸭致病力的影响。结果显示：与亲本株相比，KYF39＿09285基因缺失株的生长速度、生化特性、对Vero细胞的黏附入侵能力均未发生改变，但缺失株中dnaK表达量降低，对高渗、青霉素、氨苄西林、庆大霉素和链霉素的敏感性增强，对雏鸭的致病力（LD50）降低1.84倍，45℃胁迫下的KYF39＿09285表达量显著降低。研究表明KYF39＿09285与鸭疫里默氏杆菌对高温、高渗和抗生素的耐受性以及致病力有关，结果为深入研究鸭疫里默氏杆菌的致病机制奠定基础。     

鸭疫里默氏杆菌RIA_0940基因缺失株的构建及主要生物学特性测定

【目的】通过构建鸭疫里默氏杆菌RIA_0940基因缺失株并测定其生物学特性,探讨RIA_0940基因的潜在功能。【方法】以鸭疫里默氏杆菌RA-GD株为亲本株,扩增其左右同源臂及红霉素抗性基因（ermR）盒片段,构建左同源臂-ermR抗性基因盒-右同源臂融合片段,通过自然转化的方法缺失RA-GD株RIA_0940基因,并利用PCR筛选、鉴定RA-GDΔRIA_0940基因缺失株。分别对亲本株RA-GD和缺失株RA-GDΔRIA_0940的生长特性、对雏鸭的半数致死量、感染鸭血液和组织载菌量及对Vero细胞的黏附和入侵性能进行比较分析。【结果】试验成功构建了RA-GD株的RIA_0940基因缺失株（RA-GDΔRIA_0940）;生物学特性检测结果显示,RA-GDΔRIA_0940株体外生长能力较亲本株低,基因缺失株在生长后期生长受到显著或极显著抑制（P<0.05;P<0.01）;RA-GDΔRIA_0940株对雏鸭的半数致死量是亲本株的114倍;与亲本株相比,缺失株感染鸭血液和组织的载菌量显著或极显著下降（P<0.05;P<0.01）;缺失株对Vero细胞的黏附和入侵性能均极显著低于亲本株（P<0.01）。【结论】本试验成功构建RA-GD株RIA_0940基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下生长能力较亲本株低,对雏鸭的致病力、感染鸭血液和组织载菌量及对Vero细胞的黏附和入侵性能均显著或极显著低于亲本株。本试验结果为深入研究鸭疫里默氏杆菌的分子致病机理和研制基因工程疫苗奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌AS87＿05150基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为探究鸭疫里默氏杆菌(RA) IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87＿05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150,经PCR及测序鉴定,结果显示AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150和回补株cYb2Δ5150均正确构建,缺失株的表型为16S r RNA⁺AS87＿05150 ORF^-,回补株的表型为16S r RNA⁺AS87＿05150 ORF⁺。采用荧光定量PCR (qPCR)检测Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株AS87＿05150基因的转录水平;根据上述3株菌不同时间的OD_600nm值绘制各菌株的生长曲线;采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力;将10⁷ cfu/孔的Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株分别感染Vero细胞,检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。q PCR检测结果显示,cYb2Δ5...     

禽源肠炎沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

试验旨在研究aroA基因对肠炎沙门菌生物学特性及毒力的影响。利用λ-Red同源重组技术，将从田间分离的禽源肠炎沙门菌的aroA基因进行敲除，经连续传代检测缺失株遗传稳定性，并通过细菌生长曲线、对不同生化反应管的利用情况、生物膜形成能力、对环境应激的抵抗能力及对1日龄雏鸡的毒力比较野生株和基因缺失株之间的差异。结果显示，试验成功构建缺失株，连续传30代未发现目的基因回复突变；在相同培养条件下，缺失株与野生株在相同时间进入对数生长期和稳定期，但缺失株生长速率低于亲本株；缺失株较野生株生化特性未发生改变；缺失株的生物膜形成能力及对酸、碱、高渗和热应激的抵抗能力均显著低于野生株（P<0.05）；1日龄雏鸡分别滴口接种缺失株和野生株，观察14 d，野生株组鸡全部死亡，而缺失株组无死亡。综上所述，本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的肠炎沙门菌aroA基因缺失株，缺失株生化特性和体外生长趋势未发生明显改变，但生物膜形成能力、对环境应激抵抗能力及毒力均明显下降。本研究为进一步研究肠炎沙门菌aroA基因缺失株的免疫原性奠定了基础。     

珠三角地区鸭疫里默菌主要生物学特性研究

为明确珠三角地区鸭疫里默菌的主要生物学特性,对从珠三角地区分离到的87株鸭疫里默菌进行生化试验、玻片凝集试验、药敏试验、致病性检测及16 S rRNA基因测序,以比较相互间的生物学特性及其同源性.结果表明,分离株的生化特性基本一致;血清型以2型为主,占65.5％,其次是1型,占14.9％,此外还有16株未定型,占18.4％;代表株对雏鸭具有很强的致病性,对头孢类药物（头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢唑林）非常敏感,而对常用抗菌药物（青霉素、氨苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素）普遍耐药;本试验检测的19株代表菌的16 S rRNA基因序列的同源性较高,16 S rRNA基因与菌株的血清型和致病性无直接关系.     

鸭疫里默氏杆菌TonB依赖性受体TbdR2基因缺失株的构建

用PCR方法扩增tbdR2基因的左右臂和壮观霉素抗性基因表达盒,然后将以上3个片段组成的同源重组同源臂LSR连接到自杀性质粒pDS132上,构建得到重组自杀质粒pDS-TbdR2-LSR.再将此质粒通过接合转导的方法导入到鸭疫里默氏杆菌CH3株.用含卡那霉素和壮观霉素的TSA筛选可能的基因缺失株,并对其进行PCR鉴定,获得基因缺失株CH3△tbdR2.CH3△tbdR2稳定性检测结果表明该缺失株能够稳定存在.另外,CH3△tbdR2突变株在电镜下的细菌形态以及在TSA培养基上的菌落形态与野生株CH3相似.表明通过自杀质粒同源重组的方法获得了鸭疫里默氏杆菌CH3株TonB依赖受体TbdR2的基因缺失株CH3△tbdR2,为下一步研究TbdR2的功能奠定了基础.     

鸭疫里默氏菌基因分型

在鸭疫里默氏菌 (RA)血清分型的基础上 ,以提取的 RA基因组 DNA为模板 ,进行 Rep- PCR扩增。根据扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱 ,将分属于 8个血清型的 4 0株 RA区分为 12个不同的基因型 ,不同血清型 RA的图谱有明显差异 ,相同血清型 RA的图谱也存在差异。这些结果显示 ,RA基因组中重复的基因外的回文结构可用于区别相同血清型的不同分离株 ;Rep- PCR作为一种实用的分子生物学方法 ,在分子流行病学研究中可对 RA分离株进行基因定型     

鸭疫里默氏杆菌生物学特性研究进展

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（riemerella anatipestifer,RA）引起的感染家鸭、火鸡和其它多种鸟类的一种接触传染性疾病,临床以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为特征,俗称传染性浆膜炎。该病分布范围广,发病率、死亡率高,是目前危害各国养鸭业最为严重的传染病之一。药物预防是目前控制该病的主要措施之一,但是随着抗生素的滥用,RA对大多常用药物产生耐药性,在生产中的防治效果并不理想,因此,药物防治该病存在很大的局限性,而免疫接种则成为控制该病更为有效的措施。     

宽谱鸭疫里默氏菌噬菌体筛选及生物学特性研究

【目的】筛选宽谱鸭疫里默氏菌噬菌体,作为治疗用噬菌体组合的候选毒株。【方法】以不同含量的噬菌体进行噬斑分析测定35株噬菌体的噬菌谱;利用透射电镜观察、热与酸碱稳定性评估、最佳感染复数(MOI)测定、一步生长试验、杀菌试验分析噬菌体的形态结构和部分生物学特性。【结果】35株噬菌体中vB＿RanS＿202的裂解谱最宽,能裂解42%(42/100)的鸭疫里默氏菌,包括血清1、2、6、10、11和13型共6种血清型菌株。该噬菌体由直径约60 nm的截面为六边形的头部和长约220 nm的尾部组成,不耐热,效价为1.0×10⁷ PFU/mL的噬菌体,经50℃水浴80 min或60℃水浴20 min,即降为1.8×10⁵～2.6×10⁵ PFU/mL。在pH 5.0～9.0的环境中能维持活性。以RAf488为宿主菌测得其最佳MOI为0.01。一步生长曲线显示,其潜伏期和暴发期分别为60和75 min,平均裂解量约为150 PFU/cell。在宿主菌RAf488中的杀菌试验结果显示,MOI在0.004～0.016时,vB＿RanS＿20...     

8株鸭疫里默氏杆菌安徽分离株的生物学特性分析

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染引起的主要发生于鸭的一种慢性或急性、高度接触性传染病。本研究开展了2017年分离自安徽的8株RA菌株的生物学特性研究。血清型检测结果表明,8株RA中6株为血清10型,2株为血清15型;对24种抗菌药物敏感性检测结果表明,RA对阿莫西林、头孢他啶和头孢吡啶敏感,对洛美沙星和阿奇霉素耐药;生物被膜检测结果表明,8株菌株中有7株为强生物被膜形成株,1株为弱生物被膜形成株;运用real-time PCR对强生物被膜形成菌株AH-1和弱生物被膜形成菌株AH-35中的生物被膜形成相关的5个基因进行检测,结果表明,与AH-35菌株相比,AH-1中的Riean_0023、Riean_1039和Riean_1564基因的转录水平均显著上调(p0.01)。本研究为安徽省RA的防控提供参考。     

鸭疫里默氏杆菌明胶酶的纯化及特性分析

为阐明鸭疫里默氏杆菌明胶酶的特性,试验以液化明胶的AF株为研究对象,纯化了其明胶酶,并对该酶进行热稳定性、蛋白化学修饰剂抑制作用、金属离子及络合物的影响和致病性等特性分析。结果表明,鸭疫里默氏杆菌AF株的培养上清经超滤浓缩、70%硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、疏水柱层析和凝胶柱层析,可获得纯化的明胶酶,SDS-PAGE显示单条带,相对分子质量约59000。该酶在65℃迅速失活,Cu2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+对酶活性有强烈的抑制作用,络合物EDTA和EGTA的抑制作用可被Ca2+逆转,PMSF、NBS和AAD可抑制其活性。明胶酶对雏鸭具有毒力,能缩短鸭疫里默氏杆菌致病菌株感染的潜伏期和致死动物的时间,显著提高动物的死亡率。以上结果表明,鸭疫里默氏杆菌明胶酶是一种具有致病作用的金属蛋白酶。     

猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

猪链球菌溶血素(SLY)是较早确定的猪链球菌毒力因子之一,具有细胞毒性,在猪链球菌致病过程中发挥重要作用。利用同源重组技术成功构建了猪链球菌2型(SS2)sly基因缺失的突变株SS2-Δsly,缺失株的体外溶血活性消失,对小鼠脑血管内皮细胞的细胞毒性显著低于亲本菌株(P<0.01),但不影响猪链球菌2型在巨噬细胞中的存活。该菌株可以用于研究SS2溶血素在感染细胞中的作用机制。     

Construction and Identification of Brucella WadC Gene Deletion Strain

The purpose of the test was to analyze the role of the glycosyltransferase-encoding gene WadC in affecting the intracellular survival of Brucella.Using the Brucella sheep Rev.1 genome as template,the fusion fragments of the homologous arms of the upper and lower arms of WadC gene were obtained by homologous recombination,and ligated to the vector pUC19-SacB to construct the pUC19-SacB-ΔwadC recombinant vector,which was transferred to sheep species Brucella Rev.1,constructing a ΔwadC deletion strain (Rev.1ΔwadC),testing the genetic stability of the strain Rev.1ΔwadC,comparing and analyzing the growth characteristics of the parental strain Rev.1 and the deletion strain Rev.1ΔwadC and the BMDC and RAW264.7 viability of cells.The results showed that the gene-deficient strain was successfully constructed in the experiment,and no genetic back mutation was found in 30 consecutive passages.Under the same culture conditions in vitro,the growth trend of the deleted strain Rev.1ΔwadC was similar to that of the parental strain Rev.1,and both reached logarithmic growth period at 20 h and reached plateau period at 44 h.When the BMDC cells were infected at 48 and 72 h,the intracellular survival rate was significantly lower than that of the parent strain (P<0.05).The RAW264.7 macrophage test of infected mice showed that the parent strain had no significant difference with the gene deletion strain (P>0.05).To sum up,this experiment successfully constructed and obtained a strain of Brucella WadC gene with good genetic stability.The deletion strain had similar growth trend with the parent strain under in vitro culture conditions;However,the survival ability of the deletion strain in BMDC cells was significantly weakened.This study laid a foundation for further study on the function of WadC gene of Brucella.     

羊种布鲁氏菌WadC基因缺失株的构建与鉴定

试验旨在分析糖基转移酶编码基因WadC影响布鲁氏菌胞内存活的作用。以羊种布鲁氏菌Rev.1基因组为模板,通过同源重组方法获得WadC基因上、下游同源臂融合片段,并与载体pUC19-SacB连接,构建pUC19-SacB-ΔwadC重组载体,电转至羊种布鲁氏菌Rev.1,构建ΔwadC缺失株（Rev.1ΔwadC）,检测菌株Rev.1ΔwadC的遗传稳定性,比较分析亲本株Rev.1和缺失株Rev.1ΔwadC的生长特性及其在BMDC和RAW264.7细胞中的生存能力。结果显示,试验成功构建基因缺失株,连续传代30次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株Rev.1ΔwadC与亲本株Rev.1生长趋势相似,均在20 h到达对数生长期,44 h进入平台期;侵染BMDC细胞48和72 h时,其胞内存活率显著低于亲本株（P<0.05）;而侵染小鼠RAW264.7巨噬细胞试验显示,亲本菌株和基因缺失株无显著性差异（P>0.05）。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌WadC基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在BMDC细胞内的存活能力显著变弱,为深入研究布鲁氏菌WadC基因功能奠定基础。     

布鲁氏菌vceA基因缺失株的构建及生物学特性研究

试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究

【目的】 试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】 利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1 800 V电压、400 Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】 试验成功获得片段大小为522、539、1 054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】 本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。     

鸭疫里默氏杆菌MFS外排泵rant基因缺失株的构建及其介导的耐药性

旨在构建鸭疫里默氏杆菌rant基因缺失株及回复株,明确MFS外排泵Rant对鸭疫里默氏杆菌耐药性的影响.本研究以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株为研究对象,通过自杀质粒pRE112介导的同源重组,以红霉素抗性标记进行正向筛选,获得基因缺失株△rant,并以大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭质粒pCPRA作为载体,构建回复株c△...