鸡IL-2在新城疫病毒F基因疫苗免疫中的作用

利用国内首次克隆成功的鸡 IL- 2基因真核表达质粒与新城疫病毒 (NDV) D2 6株 F基因真核质粒 (F基因疫苗 )联合免疫 SPF雏鸡 ,观察了其诱导的免疫应答及免疫保护作用 ,以及不同免疫方式对其免疫作用的影响。结果证实了国内克隆鸡 IL- 2基因的免疫增强作用 ,以及作为免疫佐剂应用于禽类基因免疫的可行性 ,为鸡 IL- 2这一新型佐剂的实际应用提供了重要的试验依据。     

不同方法诱导鸡IL-2基因转录及cDNA克隆的研究

应用反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导的鸡胚和成鸡脾脏及成鸡白细胞中提取的总RNA中扩增得到鸡白介素-2(IL-2)基因cDNA。结果表明：以50倍或100倍稀释度接种鸡胚48h提取脾脏总RNA扩增效果最好；以5倍或10倍免疫剂量免疫成鸡48-72h，提取脾细胞或血液白细胞总RNA扩增效果最佳。为进一步研究鸡IL-2基因分子生物学特性提供了简便的诱导方法。     

鸡IL-2基因的克隆及GST-chIL2融合蛋白的表达

根据Sundick等发表的鸡IL-2基因(chIL2)序列设计合成特异性引物,用RT-PCR从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞扩增出450 bp的目的片段,酶切鉴定及序列测定结果表明为鸡IL-2基因。该基因包括鸡IL-2基因的全部开放阅读框,编码142个氨基酸组成的蛋白质,与GenBank鸡IL-2基因相比,在编码氨基酸的49位有一个氨基酸缺失;而与Broiler、SC、Chenren和Xiaoshan鸡在编码氨基酸上完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel来航鸡、来航SPF鸡、Obese、Silky和Xianju鸡等有1-4个氨基酸的差异;与火鸡和鹌鹑的氨基酸同源性分别为69.9%和59.4%。将克隆到的基因插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-6p-1中,得到重组表达质粒pGEX-IL2。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,表达出了大小约为40 ku的GST-chIL2融合蛋白,其中GST部分为26 ku,鸡IL-2为14 ku,与预期的鸡IL-2成熟蛋白大小一致。     

重组鸡IL-2的抗球虫作用

鸡白细胞介素2(Ch IL-2)是一种重要的细胞因子,对Ch IL-2的抗球虫作用做了初步研究,分别在14日龄和21日龄给实验雏鸡胸部肌肉注射不同剂量的重组Ch IL-2蛋白,28日龄口服接种1×105个活球虫卵囊,结果表明,重组Ch IL-2蛋白能降低相对卵囊产量、减少盲肠病变、提高相对增重。其中以注射250μg重组Ch IL-2蛋白的试验组抗球虫效果最好,相对卵囊产量为23.26%,盲肠病变记分分别为0.4,相对增重率为97.80%,综合抗球虫指数(AC I)达到192.8。抗球虫效果良好,明显的优于其他试验组。     

华东27个地方鸡品种(品系)的遗传变异

应用30个微卫星标记对华东27个地方鸡品种（品系）进行了遗传多样性分析，计算了多态信息含量、平均杂合度和遗传距离等遗传参数，并用类平均法进行了聚类分析。结果表明：平均杂合度最高的是河田鸡，为0．6870，最低的是狼山鸡，为0．6170；27个地方鸡品种（品系）的杂合度都较高，反映了这些品种的多种多型；各品种的平均遗传距离反映了各品种分化时间的长短；UPGMA的聚类分析将27个品种（品系）聚为10类：丝绒乌骨鸡、济宁百日鸡、河田鸡、安义瓦灰鸡、仙居鸡、江山乌骨鸡、溧阳鸡、金湖乌风鸡、灵昆鸡、余干乌骨鸡、康乐鸡、萧山鸡、琅讶鸡、淮北麻鸡、淮南三黄鸡为第1类，白耳鸡为第2类，浦东鸡为第3类，崇仁麻鸡与丝羽乌骨鸡为第4类，狼山鸡与寿光鸡为第5类，鹿苑鸡、东乡绿壳蛋鸡、汶上芦花鸡各独自聚为第6、7、8类，鲁西斗鸡与宁都三黄鸡聚为第9类，漳州斗鸡独自聚为第10类。通过微卫星标记对华东27个地方鸡品种（品系）遗传变异的分析说明这些地方品种的遗传多样性极其丰富，各具特色，应促进资源优势向经济优势转化。     

海兰鸡IL-18全基因的克隆与序列分析

IL-18是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计一对引物,经植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后,提取其总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行了T-A克隆、测序,获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp,与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

鸡IL-4和IL-2重组融合基因佐剂对鸡球虫活疫苗的增效作用研究

为了研究鸡白细胞介素4(IL-4)和IL-2重组基因佐剂pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP对鸡球虫活疫苗的增效作用,试验采用基因佐剂配合鸡球虫活疫苗对雏鸡进行免疫攻毒试验,测定该基因佐剂的最小有效剂量、给药途径,使用该基因佐剂对鸡球虫活疫苗的最短免疫间隔时间和免疫产生期的影响。结果表明：抗球虫指数(ACI)和相对增重率(RWG)随着基因佐剂剂量增高而升高,肌肉注射100μg/只时,ACI(189.32)和RWG(90.35%)达到高峰;口服基因佐剂300μg/只组的ACI(188.41)与肌肉注射基因佐剂100μg/只组接近;肌肉注射佐剂免疫攻毒组的两次免疫最短间隔时间(6 d)较不加基因佐剂组(7 d)缩短1 d;肌肉注射佐剂免疫攻毒组的免疫产生期为二免后第5天,较无基因佐剂免疫攻毒组提前1 d。说明肌肉注射IL-4和IL-2重组基因佐剂pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 100μg/只可提高鸡球虫活疫苗的免疫效果,缩短免疫产生期和免疫间隔。     

鸡IL-15、IL-16和IL-18基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank上鸡白介素15(IL-15),白介素16(IL-16),白介素18(IL-18)基因的序列,在保守区设计并合成各自特异引物,并以β-actin基因为内参,采用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量PCR检测方法.将基因克隆至pMD19-T载体上,以各阳性质粒作为标准品,构建标准曲线,并进行了熔...     

粤黄鸡IL-15基因真核表达及其多克隆抗体的制备

本研究参照GenBank登录的鸡白细胞介素15(ChIL-15)基因序列自行设计一对特异性引物,以RT-PCR、基因克隆,重组真核表达质粒构建、表达及试验兔免疫等技术,成功获得粤黄鸡IL-15基因:全长564 bp,编码187个氨基酸,与GenBank上已发表的其它品种鸡IL-15基因序列及其推导的氨基酸序列相似性为99.1％～100％;成功构建鸡IL-15基因重组真核表达质粒pcDNA-ChIL-15；成功制备兔抗鸡IL-15多克隆抗体.为进一步研究粤黄鸡IL-15的生物学功能,试验pcDNA-ChIL-15作鸡的各种新型DNA疫苗的分子免疫佐剂等奠定基础.     

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定（RIA）法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化、IL-2基因表达与分泌的影响。结果表明，用10ng／mL和lng／mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8h后，能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应，显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量（P〈0．05）；100ng／mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势，但与对照组无显著差异（P〉0．05）。提示，胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应，并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌，其作用与弃3量大小有关。     

细胞因子IL-2和IL-12在基因免疫中的佐剂作用

基因免疫(Gene immunization)又称DNA免疫或核酸免疫,是指将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)与质粒重组后,利用某种方法直接导入动物细胞内,使带有目的基因的表达载体转化到体内,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生针对该抗原的抗体并引起特异的免疫应答以     

猪IL-2基因在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

本研究根据密码子偏爱原则设计猪IL-2引物,克隆其基因后构建pPIC9k-IL-2重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母GS115,获得优化密码子的重组酵母转化子;再用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,不同条件下进行甲醇诱导表达。结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中。表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量为16、20ku两条目的蛋白表达带,脱糖基化分析表明目的蛋白得到了适度的糖基化修饰,Western blotting分析显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性,分子筛纯化可以获得纯度为95%的蛋白质,淋巴细胞增殖活性分析表明所得的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的活性。毕赤酵母表达系统可以高效地表达具有生物活性的重组猪IL-2蛋白分子。     

PCV2ORF2基因与猪IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

为研制新型的PCV2基因疫苗,本研究将PCV2ORF2和猪IL-18基因插入真核表达质粒pIRES中,构建共表达capsid (Cap)蛋白和猪IL-18的质粒pIRES-OFR2/IL18和表达Cap蛋白的质粒pIRES-OFR2.将质粒pIRES-OFR2/IL18和pIRES-OFR2通过腿部肌肉多点注射8周龄昆明小鼠,间隔3周再免疫1次.加强免疫3周后用PCV2 Wuzhi株进行攻毒.pIRES-OFR2/IL18免疫昆明小鼠后能促进外周血T淋巴细胞增殖和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强PCV2 DNA疫苗对强毒的攻击保护,pIRES-ORF2/IL18免疫组要优于pIRES-ORF2免疫组及其它对照组,差异显著.表明猪IL-18基因与PCV2ORF2共表达可增强猪体对DNA疫苗的免疫应答,提高对PCV2强毒的抵抗力.     

基于ND2基因的崖沙燕遗传多样性和遗传结构初探

利用线粒体DNA中的NADH脱氢酶第二亚基(ND2)对来自齐齐哈尔市50个崖沙燕(Riparia riparia)样本进行扩增和测序,发现了11条新的单倍型序列。结合从GenB ank中下载的104条序列,对崖沙燕3个亚种种群(154只个体)进行序列变异及系统发育分析。结果显示,3个亚种种群中有2个共享单倍型。群体总的单倍型多样性(Hd)为(0. 885±0. 019),群体总的核苷酸多样性(Pi)为(0. 002 92±0. 000 18)。与其近缘物种淡色崖沙燕(Riparia diluta)相比较,崖沙燕种群表现出较低水平的遗传多样性。分子方差分析(AMOVA)显示变异主要来自种群内(72. 82%)。构建的单倍型系统发育树表明,62个单倍型没有形成明显的亚种分化和地理分化。     

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AH5AIL6)的遗传稳定性,本研究将其接种CEF,绘制生长曲线.结果显示,该重组病毒与亲本病毒的生长速度及蚀斑大小一致;在CEF 连续培养20代,取第0代、5代、10代、20代重组病毒PCR扩增HA和Ⅱ-6基因进行鉴定,显示HA基因无核苷酸突变,IL-6基因在第20代时有1个氨基酸发生突变,但不影响该蛋白的功能区;间接免疫荧光试验证明所选代次病毒均能够表达HA蛋白,RT-PCR试验表明各代次病毒均可以表达鸡IL-6基因;通过蓝斑鉴定重组病毒纯度,结果显示所有蚀斑均为蓝斑.因此,该重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性,符合兽医生物制品的生产要求.     

细胞因子IL-2和IL-4对病毒保护性抗原基因真核表达影响的研究

如何提高和改善疫苗的免疫效果是目前疫苗研究的热点,近年来许多研究发现与DNA疫苗联合应用的细胞因子可通过不同的环节调节和增强DNA疫苗免疫效应,白细胞介素作为免疫佐剂能协同DNA疫苗能取得较好的免疫效果。细胞因子是动物体内特异高效调控免疫细胞和协调免疫应答重要的信号分子,它主要包括淋巴毒素(LT)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(INF)、白细胞介素(IL,如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12)和集落刺激因子(GM-CSF)等。其中IL-2和IL-4对病毒保护性抗原基因真核表达影响的研究较多。主要综述了IL-2和IL-4作为免疫佐剂对病毒保护性抗原基因真核表达的影响,以期为更深入地进行IL-2和IL-4对DNA疫苗免疫增强作用的深入研究提供参考。     

鸡IL-18基因的克隆与序列测定

根据Genbank发表的鸡IL-18基因序列,设计一对引物,提取鸡脾细胞总RNA,经RT-PCR扩增和扩增产物的克隆、测序,获得了中国江西土鸡IL-18基因片段,其大小为597bp,与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18的基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

不同鸡品种TYR基因遗传变异分析

采用PCR-SSCP方法,对中国宁夏固原鸡、海南文昌鸡、西藏藏鸡和国外引进海赛克斯鸡TYR基因5′侧翼区及外显子13个位点（P1、P2、P3）的遗传变异进行研究。结果表明,P2位点无多态,P1位点在3个中国鸡品种中均出现3种基因型,分别为AA型、BB型和AB型;在引进的海赛克斯鸡中,只检测到BB型和AB型2种类型。4个鸡品种在该位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态;P3位点在中国3个鸡品种中均检测到3种基因型,分别为AA型、BB型和AB型,而海赛克斯鸡中只检测到AA和AB型,固原鸡和文昌鸡在该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,藏鸡和海赛克斯鸡均处于极不平衡状态。进一步说明,中国地方鸡品种的TYR基因蕴藏丰富变异资源。经克隆测序分析,P1位点存在C→T的单碱基替换突变,P3位点存在G→A的单碱基替换突变,但未引起氨基酸突变。独立χ2分析显示,两位点基因型和等位基因分布在不同鸡品种之间存在显著或极显著差异（P〈0.05和P〈0.01）,提示TYR基因的基因型和等位基因分布与鸡品种因素显著相关。本研究为以后对鸡TYR基因5′侧翼区及外显子1的进一步研究提供基础依据。     

鸡IGFBP-2基因的遗传多态性及其遗传效应分析

采用PCR-SSCP方法检测京海黄鸡、AA鸡、尤溪麻鸡、边鸡4个鸡品种胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)第2内含子部分序列和第3外显子的多态性,并分析其对京海黄鸡生长和繁殖性能的遗传效应。结果表明:在该区域中,共检测到4个等位基因,10种基因型。χ2检验结果表明,除边鸡外其余3个品种群体在该座位均达到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。关联分析结果显示,除开产蛋重和12周龄体重外,其他生长和繁殖性状在不同基因型间均存在显著差异(P<0.05)。因此,推测IGFBP-2基因对个体的生长和繁殖性能有一定影响,将IGFBP-2基因应用于鸡育种过程中的标记辅助选择可以加快鸡的育种进程。