陕西和辽宁部分地区羊源媒介蜱类及其携带病原体调查

为了对陕西省和辽宁省部分地区羊源蜱类及其携带病原体的流行情况进行分析,本试验采集了288份羊源蜱样本,采用形态学观察鉴定蜱种;采用分子生物学方法扩增巴贝斯虫18S rRNA、伯氏疏螺旋体16S rRNA、斑点热群立克次体ompA和无形体16S rRNA的基因序列,并结合核苷酸序列分析,确定所收集蜱样本中各类病原体的流行情况。结果显示,经鉴定288份羊源蜱样本均为长角血蜱。陕西省144份长角血蜱中携带巴贝斯虫、斑点热群立克次体和无形体,感染率分别为0.69%、21.53%和77.78%,且巴贝斯虫和斑点热群立克次体均与无形体复合感染;其中长角血蜱中携带Babesia microti、Candidatus Rickettsia longicornis、Uncultured Rickettsia sp. QH-122、Rickettsia endosymbiont of Haemaphysalis longicornis、Uncultured Anaplasma sp. ZJ06/2009、Anaplasma marginale、Anaplasma capra共7种病原体。辽宁省144份长角...     

古尔班通古特沙漠南缘蜱携带无形体的调查

为了解古尔班通古特沙漠南缘蜱携带无形体的状况,在该地域3个不同生境区域11个地点采集家畜寄生蜱标本,进行分类鉴定;运用套式PCR筛选无形体阳性蜱样本,并用半套式PCR扩增无形体科16SrRNA基因5′端高变区,进行克隆测序;将所获得的DNA序列与GenBank收录的序列作比对,并用Mega 5.0软件构建系统发育树,鉴定蜱携带无形体的种类。结果共采集708只蜱,鉴定为4个属8个种。在分类后的236份蜱样本中,检测出无形体阳性25份,阳性率为10.59%。序列比较发现,在亚洲璃眼蜱、血红扇头蜱、残缘璃眼蜱、长角血蜱中分别存在查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）、犬埃立克体（Ehrlichia canis）、边缘无形体（Anaplasma marginale）和绵羊无形体（Anaplasma ovis）的16SrRNA基因片段。研究结果证实在古尔班通古特沙漠南缘家畜寄生蜱中携带无形体,提示该地域可能是无形体病的自然疫源地。     

嗜群血蜱和长角血蜱ITS-2、COⅠ和COⅡ基因序列变异与亲缘关系分析

本研究旨在阐明长角血蜱与嗜群血蜱间的亲缘关系。采用聚合酶链式反应(PCR)技术从长角血蜱和嗜群血蜱基因组DNA中扩增得到核糖体第二内部转录间隔区基因(ITS-2)片段、线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)片段和线粒体细胞色素氧化酶亚基II基因(COⅡ)片段,并进行测序,进而分析其基因变异与系统发育。结果表明,长角血蜱和嗜群血蜱的ITS-2、COⅠ和COⅡ基因片段的大小存在差异,长角血蜱3种基因分别为361、479和647bp,嗜群血蜱基因分别为354、474和661bp。长角血蜱与嗜群血蜱间ITS-2、COⅠ和COⅡ基因的相似性分别为84.2%、89.0%和88.4%。以3种基因构建的NJ进化树中,长角血蜱和嗜群血蜱均聚类。因此,认为长角血蜱和嗜群血蜱间ITS-2、COI和COII基因间变异较小,它们是血蜱属中亲缘关系较近的2个有效种,支持传统形态学的分类地位。     

嗜群血蜱和长角血蜱ITS-2、COI和COⅡ基因序列变异与亲缘关系分析

本研究旨在阐明长角血蜱与嗜群血蜱间的亲缘关系.采用聚合酶链式反应(PCR)技术从长角血蜱和嗜群血蜱基因组DNA中扩增得到核糖体第二内部转录间隔区基因(ITS-2)片段、线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因(COI)片段和线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因(COⅡ)片段,并进行测序,进而分析其基因变异与系统发育.结果表明,长角血蜱和嗜群血蜱的ITS-2、COⅠ和COⅡ基因片段的大小存在差异,长角血蜱3种基因分别为361、479和647 bp,嗜群血蜱基因分别为354、474和661 bp.长角血蜱与嗜群血蜱间ITS-2、COⅠ和COⅡ基因的相似性分别为84.2%、89.0%和88.4%.以3种基因构建的NJ进化树中,长角血蜱和嗜群血蜱均聚类.因此,认为长角血蜱和嗜群血蜱间ITS-2、COⅠ和COⅡ基因间变异较小,它们是血蜱属中亲缘关系较近的2个有效种,支持传统形态学的分类地位.     

长角血蜱保护性抗原基因P27/30的克隆和原核表达

采用RT—PCR技术首次从孤雌生殖长角血蜱四川株克隆到P27／30基因,扩增序列全长670bp,包含完整的开放阅读框,编码201个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为23．38ku。同源性分析表明孤雌生殖长角血蜱中国株与日本株P27／30基因同源性高达99．85％。经RT—PCR检测分析,该基因在孤雌生殖长角血蜱的卵、幼蜱、若蜱、饥饿成蜱和饱血成蜱这几个阶段均有表达。将该基因亚克隆后连接到pET32a（＋）原核表达载体,转化BL21（DEa）宿主菌,经IPTG诱导可成功进行表达。表达的目的蛋白大小为24ku左右,与预期大小一致;Western-blot显示兔抗长角血蜱全虫抗体能够识别该重组表达蛋白。     

基于cox1基因序列分析山羊褐黄血蜱种系发育关系

为分析山羊褐黄血蜱分离株的线粒体(mt DNA)部分序列(pcox1)的遗传变异情况,并利用cox1序列分析山羊褐黄血蜱与其它蜱的种群遗传关系,本研究利用PCR扩增山羊褐黄血蜱的部分cox1片段,并对其进行测序分析。结果显示16株山羊褐黄血蜱分离株的cox1序列长度均为800 bp左右,且分离株与基因库中褐黄血蜱位于同一分支,与其它蜱类得到了很好的鉴别。本研究表明pcox1序列种内相对保守,种间差异较大,可作为山羊褐黄血蜱的种间遗传变异研究的分子遗传标记。     

长角血蜱甘肃株肌钙蛋白基因P27/30的克隆和序列分析

参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株肌钙蛋白P27/30基因的核苷酸序列,设计合成一对引物,从本实验室保藏的干净长角血蜱卵中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出607 bp的肌钙蛋白基因,将其克隆于PGEM-T-Easy载体,对其进行序列分析,并推导出氨基酸序列,将这一序列与国内外已发表的长角血蜱肌钙蛋白基因进行比较分析。结果表明本实验室保藏的长角血蜱甘肃株与上述已发表的Okayama株核苷酸序列同源性为92.1%,氨基酸同源性为86%。长角血蜱甘肃株与Okayama株、四川孤雌生殖株的发育有一定差异。经RT-PCR分析表明,该基因在长角血蜱的卵、幼蜱、若蜱和饥饿成蜱这几个阶段均有表达。     

唐山地区蜱传斑点热群立克次体分子流行病学

根据已发表的长角血蜱16SrRNA序列及斑点热群立克次体外膜蛋白A（OmpA）基因序列设计2对特异性引物,对唐山地区采集的长角血蜱进行PCR检测,并对阳性样本进行测序和序列分析,抽检样本建立分子系统进化树。结果表明,在315份蜱DNA样本中检测出25份阳性样本,阳性率为7.94%;序列分析结果显示唐山地区长角血蜱携带立克次体同处于一个分支,与日本株立克次体同源性最高（93.30%）,其次是福建株立克次体（92.11%）,黑龙江立克次体绥芬株（90.45%）、虎林株（90.42%）。结论得出唐山地区蜱传斑点热感染较严重,分子进化分析结果显示唐山地区蜱传斑点热群立克次体可能为一新种。     

吉林省牛东方泰勒虫与嗜吞噬细胞无形体的流行病学调查

为了进一步了解吉林省牛东方泰勒虫和嗜吞噬细胞无形体的流行情况,对采自吉林省洮南,松原,珲春3个地区的103份牛血液样本,采用PCR和巢式PCR方法分别东方泰勒虫与嗜吞噬细胞无形体进行检测。结果显示,东方泰勒虫在洮南、松原和珲春地区的感染率分别为8.7%,12.5%和92.5%,嗜吞噬细胞无形体在洮南、松原和珲春地区的感染率分别为0,7.5%和12.5%。本研究首次在吉林省洮南地区和松原地区牛体内检测到东方泰勒虫,首次在松原地区和珲春地区牛体内检测到嗜吞噬细胞无形体。本研究结果为吉林省控制和预防牛东方泰勒虫病与嗜吞噬细胞无形体病提供了有效的流行病学依据。     

山东省媒介蜱类种类鉴定及羊泰勒虫病流行病学调查

为了阐明山东省蜱类种类及羊泰勒虫病流行概况,于2012年3月-2013年11月采用形态学鉴定法鉴定收集的14 878只蜱类标本;采用梨形虫、泰勒科通用引物及种属特异性引物对617份羊血液样品进行PCR检测,并对阳性样品18SrRNA基因进行遗传进化分析;分析不同月份蜱类活动频率及羊泰勒虫感染率。结果显示山东省长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)和草原革蜱(Dermacentor nuttalli)所占比例分别为75.3%和24.7%,统计学分析显示长角血蜱显著多于草原革蜱(P0.05),为山东省优势蜱种。PCR检测结果显示山东省羊泰勒虫感染率为24.8%;其中吕氏泰勒虫感染率为12.0%、尤氏泰勒虫感染率为11.8%,混和感染率为5.3%,没有检测到绵阳泰勒虫感染,统计学分析显示吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫在羊群的感染率无统计学差异(P0.05),吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫单虫种感染率显著高于混合感染率(P0.05)。遗传进化分析显示山东省吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫与北京分离株分布于同一分支,而区别于西北地区和南方地区分离株,呈现区域聚集性;不同月份蜱类活动频率与羊泰勒虫感染率呈现季节相关性。上述结果表明山东省优势媒介蜱种为长角血蜱,羊泰勒虫感染虫种为吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫,感染率较高,且与媒介蜱类存在相关性,为山东省羊泰勒虫病防控提供科学实验依据。