马传染性贫血病毒囊膜基因gp90V3区糖化回复突变感染性克隆的构建

为阐明我国马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）弱毒疫苗致弱及免疫保护的分子机制,作者分析了疫苗株及其亲本强毒株共34个囊膜基因序列。结果发现疫苗株在膜基因gp90V3区的潜在N-连接糖基化位点出现稳定的碱基替换,使该位点消失。为研究囊膜糖基化的作用,以疫苗株全长感染性克隆pLG—FD3—8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行糖基化序列回复操作,构建全基因感染性克隆pLGFDg5。将pLGFDg5转染驴胎皮肤细胞（FDD）,通过逆转录酶活性和RT-PCR方法评价其感染性。结果表明,将pLGFDg5在FDD细胞中盲传3代后,可在细胞培养上清中检测到逆转录酶活性,用RT—PCR检测到EIAV保守基因片段,在电镜下可见典型的EIAV粒子。在FDD细胞上的病毒复制动力学分析显示,与其亲本克隆pLGFD3—8的衍生病毒pLGFD3-V相比,回复突变克隆衍生的pLGFDg5-V复制速度较慢,获得较低的病毒载量。体外抗体中和试验表明,与其亲本pLGFD3-V相比,引入潜在的糖基化位点g5降低了衍生病毒对中和抗体的敏感性。这一结果为N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究提供了重要依据。     

马传染性贫血驴强毒gp90基因的克隆和序列分析

以EIAV驴强毒株D-AmRNA为模板，利用RT-PCR技术，扩增了约1．4kb的gp90基因。将其克隆后进行了测序。测序结果表明所扩增的1338个核苷酸片段含有完整的gp90基因全序列。核苷酸和氨基酸序列比较分析结果表明：D-A EIAV与国内分离株辽系强毒L株差异率仅有1．8％，而与国外毒株(克隆1369，WENVl7、WENVl6、PSPEIAVl9)核苷酸差异率在35．5％～37．2％之间；D-A株与国内分离株L株氨基酸水平差异率在2．9％，而与国外毒株氨基酸水平上的差异率在42．6％—46．0％；D-AEIAV有19个N-连接糖基化位点，L株、WENVl7和WENVl6是18个，克隆1369、WENVl6和WENVl7亲本毒株PSPEIAVl9是12个。     

The determination of in vivo envelope-specific cell-mediated immune responses in equine infectious anemia virus-infected ponies

Distinct from human lentivirus infection, equine infectious anemia virus (EIAV)-infected horses will eventually enter an inapparent carrier state in which virus replication is apparently controlled by adaptive immune responses. Although recrudescence of disease can occur after immune suppression, the actual immune correlate associated with protection has yet to be determined. Therefore, EIAV provides a model for investigating immune-mediated protective mechanisms against lentivirus infection. Here, we have developed a method to monitor EIAV-envelope specific cellular immunity in vivo. An EIA carrier horse with no clinical signs infected 7 years ago and 4 related experimental ponies infected 6 months previously were used in this study. Forty-four 20-mer peptides, representing the entire surface unit protein (gp90) of EIAV, were combined into 14 peptide pools and intradermally injected into the neck of EIAV-infected horses. An identical volume of saline alone was injected into a fifteenth site as a negative control. After 48h, those sites with palpable infiltrations were measured prior to the collection of 2mm and 4mm punch biopsies. Total RNA was extracted from each 2mm biopsy for determination of CD3 and interferon-γ (IFN-γ) mRNA expression by real-time PCR. The 4mm skin biopsies were formalin-fixed and paraffin-embedded for immunohistochemistry (IHC) staining for CD3, CD20, CD25 and MAC387 (macrophage marker). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained prior to the injection and tested for in vitro reactivity against the same peptides. Histological examination showed that some of the envelope peptides elicited a lymphocytic cellular infiltration at the injection site, as evidenced by positive staining for CD3. Gp90 peptide-specific increases in CD3 and IFN-γ gene expression were also detected in the injection sites. Furthermore, differences were found between in vivo and in vitro responses to gp90 specific peptides. These results demonstrate a novel method for detecting in vivo cell-mediated immune responses to EIAV-specific peptides that is readily applicable to other host/pathogen systems.     

J亚群禽白血病毒gp85基因表达及初步应用

J亚群禽白血病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）的囊膜糖蛋白GP85是亚群特异性抗原。将ALV-J的gp85基因克隆至原核表达载体pET-30a（＋）EcoRⅠ和SalⅠ两个酶切位点之间,经IPTG诱导在大肠杆菌中以His-Tag融合蛋白的形式获得了高效表达,Western blot显示该表达产物具有生物学活性。GP85蛋白经纯化、复性后免疫家兔,制备了抗ALV-J GP85的多克隆抗体。以纯化的蛋白为抗原包被ELISA检测板,对疑似血清样本进行了实验室检测,检出率较高。本研究为ALV-J的诊断和流行病学调查奠定了基础。     

Antibodies and PMBC from EIAV infected carrier horses recognize gp45 and p26 synthetic peptides

Equine infectious anemia virus (EIAV) is a lentivirus causing a persistent infection in horses characterized by recurrent febrile episodes and high levels of viremia associated with a novel antigenic strain of the virus. The virus contains two envelope glycoproteins, gp90 and gp45, and four internal proteins, p26, p15, p11 and p9. Considering that the most infected horses are able to restrict EIAV replication to very low levels and that gp45 and p26 contain highly conserved epitopes among lentiviruses, it would be necessary to identify those conserved epitopes stimulating cellular and humoral responses. The aims of this study were to determine if the synthetic peptides identified as gp45 (aa 523-547) and p26 (aa 318-346) representing two highly conserved and immunodominant regions of EIA virus are recognized by PBMC and antibodies to EIAV adult mixed-breed naturally infected carrier horses, and if these peptides are able to induce immune responses in mice. Antibodies from 100% of carrier horses, evaluated by ELISA, recognized both peptides; PBMC from 80% of carrier horses, evaluated by lymphoproliferation assay, recognized, at least, one peptide. Furthermore, immunization with 100 microg of each peptide elicited humoral and cellular responses in BALB/c mice, antibodies appeared at 48 or 63 days of immunization with gp45 or p26, respectively. Although the kinetics of gp45- and p26-specific antibody responses were similar, percentage of positivity was higher for gp45. The lymphoproliferation assay, evaluated by BrdU uptake, was higher in mice immunized with gp45 or p26 than in the control group (P<0.05). Based on our findings, we consider that both peptides could be included in an effective vaccine design to induce long-term immunological memory.     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株囊膜基因的优化及其DNA疫苗体外瞬时表达研究

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)的密码子使用频率与哺乳动物间存在着明显差异。为此,对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)囊膜全长基因按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行了重新设计和合成,并以此为基础通过重叠延伸PCR、限制酶切等方法得到结合型和分泌型囊膜基因,将其插入含有鸡beta-actin/兔beta-globin复合启动子(AG)的高效表达载体pCAGGS中,构建了EIAV驴白细胞弱毒疫苗株结合型和分泌型囊膜基因的DNA疫苗质粒pCAGGS-opti-bou-env、pCAGGS- opti-sec-env。将构建的质粒纯化后分别转染293T细胞,以间接免疫荧光和Western blot方法检测转染48 h后细胞及上清中囊膜蛋白的表达。结果显示,两种表达质粒均可正确表达EIAV囊膜蛋白,与相对应未优化的表达载体pCAGGS-wt-bou-env和pCAGGS-wt-sec—env相比,密码子优化的基因体外瞬时表达水平有极为显著的提高,而且蛋白表达部位也与预期的结果符合。这一结果为EIAV囊膜蛋白的单抗制备、表位鉴定、免疫试验、新疫苗的开发等奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达

根据禽网状内皮组织增生症病毒（REV）SNV株的前病毒基因组cDNA序列，设计并合成1对引物，以SNV株前病毒CDNA全基因组克隆为模板，通过PCR技术，扩增出该病毒囊膜糖蛋白（env)gp90基因部分片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-5X-3载体中谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在1.0mmol/L IPTG(37℃）诱导下，gp90基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白相对分子质量为64000。将表达产物从凝胶中回收后免疫小鼠，所得的抗血清可与REV野毒株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在免疫荧光试验中起反应。由此表明，体外表达的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。     

马传染性贫血病毒envgp90基因在实验感染马体内的遗传变异

为确定马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）ｅｎｇ ｇｐ９０基因的遗传变异特性,本研究应用ＥＬＡＶ日本分离强毒株Ｐ３３７－Ｖ７０实验感染了１匹健康马,经第２次感染后,实验马未呈现临床症状,ｇｐ９０基因的核苷酸序列被直接从这匹马的外周血和肝脏所获得的前病毒ＤＮＡ扩增。     

I型人免疫缺陷病毒（HIV—1）中国流株B亚型Gag和Env蛋白在大肠杆菌中的表达

将中国流行株I型人免疫缺陷病毒（HIV－1）B亚型gag基因和env基因定向插入原核表达载体pET28a和pET28c，获得重组表达质粒pETG、pETM1、pETM2、pETM3。将pETG转化表达宿主菌BL21（DE3）plysS,用IPTG，诱导，SDS－PAGE电泳分析有重组蛋白表达。该蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加，4h达到最大值。凝胶扫描结果显示，该蛋白表达量占菌体总蛋白的10．3％。Westrn blotting检测，该重组蛋白可与中国流行株HIV－1B亚型阳性血清发生特异反应。重组表达质粒pETM1、pETM2和pETM3仅在蛋白印迹中与gp120单抗发生特异性反应而出现特异显色带，SDS－PAGE电泳分析未见表达蛋白带。     

马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒gag和gp90基因在马体内的变异分析

为建立美洲马传贫毒株和我国弱毒疫苗株鉴别诊断PCR，对接种马传贫阿根廷流行毒株后马4个发热期（23、40、51和70d）外周血单核细胞前病毒DNA gag基因和gP90基因的核苷酸序列进行了监测，经过序列分析发现4个发热期中前病毒gag基因核苷酸序列变化不明显，变异率在1％之内，表明前病毒gag基因在马体内比较保守，可以作为设计鉴别诊断引物的区域；gp90区的基因变化比较大，核苷酸序列变异率在8％～10％之间，通过对几个发热期核苷酸序列推导氨基酸的分析，可以划分出A1、A2、A3和A44个可变区，但其中A1和A4变异都很稳定，在马体发病的整个过程中均只发生1次变异，而A2区第3个发热期变异后，在第4个发热期又回复了突变。对马传染性贫血病毒阿根廷代表毒株前病毒gag和gp90基因核甘酸序列的动念检测结果表明，马传贫病毒在马体整合为前病毒之后比较稳定，这就为建立PCR鉴别诊断方法提供了依据。     

重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的：构建新型的马传染性贫血病毒（EIAV）的候选疫苗。方法：利用BAC-To-BAC杆状病毒表达系统,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗（EIAVDLV）及其亲本株（EIAVLN）env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后,得到的重组病毒用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAVEnv基因的重组痘苗病毒,单独或与重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白联合免疫小鼠。结果：构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比,联合免疫组免疫应答显著增强,其中中和抗体的滴度提高5—9倍。结论：含有EIAVEnv基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合务埔．能够诱导高滴座的中和抗体．     

Proviral Genomic Variation of EIAV Envelop gp 90 Gene Observed in Experimentally Infected Horse

The present experiment was designed to observe the genetic variation of equine infectious anemia virus (EIAV) envelop gp 90 gene in infected horse. One horse was infected experimentally with P337-V70 strain and showed no clinical signs after being infected at twice with the same virus strain. Seventeen proviral sequences covering principal neutralizing domain (PND) of EIAV gp 90 gene were obtained from the buffy coat and liver of the horse through PCR amplification and cloning. Comparative analysis of the sequences revealed that some sequences contained the nucleotide insertions in the PND region. The insertions might be generated by direct repeat and strand displacement of sequence segment in their PND gene, showing different lenghts.     

中国流行株HIV及其与细胞因子基因共表达核酸疫苗质粒的构建及表达

以表达中国流行株HIV-1gp120基因的核酸疫苗质粒pGP及共表达中国流行株HIV-1gp120基因与IFN基因的核酸疫苗质粒pG-PIFN转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光鉴定其表达产物。将上述两种质粒经胫前肌注射BALB/c鼠,检测gp120抗体的产生情况及ConA和Lps诱导的T细胞增殖能力。结果显示,荧光显微镜下pGPIFN转染细胞可见绿色荧光而pGP转染细胞未见绿色荧光。pGPIFN与pGP均可刺激小鼠产生抗gp120抗体,协同注射gp120和IFN基因的小鼠产生的抗体滴度明显高于单独注射gp120的小鼠。pGPIFN免疫鼠对ConA和Lps诱导的T细胞增殖能力明显高于单独注射gp120的小鼠。实验结果表明,协同应用IFN基因可明显加强HIV-1gp120基收稿日期:2002-07-19基金项目:国家自然科学基金项目(3977066);国家杰出青年基金项目(39825119)作者简介:郭　焱(1963-),女,吉林省长春市人,长春中医学院基础医学部副教授,硕士,主要从事分子病毒学研究工作。因的免疫反应,为中国流行株HIV-1核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。     

中国马传染性贫血病毒DLV株前病毒gp90基因在马体内的变异分析

分别以EIAV辽宁马强毒株（EIAVliao）前病毒DNA和马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株（EIAVDLV）前病毒DNA为模板,从免疫接种后不同时期马血清中利用nested—PCR技术,扩增了约1．4kb的gp90基因。将其克隆后进行了测序,测序结果表明,免疫EIAVDLV后的第1时期至第5时期,与EIAV—liao比较核苷酸序列平均差异率分别为3．2956％、3．1456oA、3．36％、3．1856％和3．6456％。EIAVliao有20个N-连接糖基化位点,EIAVDLV平均是17．2个,其中有11个N-连接糖基化位点是高度保守的。     

马传染性贫血病毒强毒株gag和gp45基因的体内进化分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株体内进化规律,将3匹马分别以1×105 TCID50/匹接种EIAVLN40强毒株后,在不同时间点采取外周血,分离单核白细胞。提取白细胞中的DNA,并以其为模板,应用套式PCR技术分别扩增EIAV前病毒DNA的p15,p9和gp45基因,经克隆后进行序列分析。结果显示,与接种前EIAVLN40相比较,p15基因核苷酸和氨基酸平均差异率分别为1.8%(0～2.9%)和1.7%(0～3.6%);p9分别为2.5%(0.3%～3.8%)和2.9%(0～4.8%);gp45-Ⅰ分别为1.3%(0.3%～2.1%)和1.8%(0～3.2%),gp45-Ⅱ分别为2.1%(0～3.4%)和2.6%(0～4.7%)。在EIA发热期,每个基因核苷酸和氨基酸差异率最小;在亚临床阶段,每个基因平均差异率总体上相对较高。氨基酸变异位点分析发现,发病期(2-2、3-1)各基因氨基酸序列回复到亲本株EIAVLN40,其余时期p15基因氨基酸稳定变异位点16N/S、88T/S和112M/E;p9基因115E/G和122K/M;gp45-Ⅰ基因9T/F/L;gp45-Ⅱ基因21E/K和29G/S。此外,p15基因进化树结果显示,发热期(2-2、3-1)p15基因序列与EIAVLN40序列处于同一分支上,亚临床阶段大多数p15基因序列处于另一个大分支上;其他基因进化情况与p15基因类似。对EIAV p15、p9、gp45基因体内进化分析,有助于对EIAV在马体内感染进程的研究,为进一步研究EIAV持续感染和逃避免疫监视的机制提供参考。     

J亚群与E亚群禽白血病自然重组病毒的全基因组序列分析

为了解我国东北地区部分养鸡场禽白血病病毒(ALV)的基因组序列特征及其变异情况,本研究从具有典型血管瘤病变的禽白血病发病鸡中分离到一株J亚群ALV(ALV-J)命名为JL0901,并进行了全基因测序.将该序列与已发表的ALV-J毒株序列进行比较研究,结果表明JL0901基因组的gag和pol基因相对保守,而env基因和3'端非编码区(3'UTR)的变异较大.对JL0901的env基因核苷酸序列进一步分析发现,在其gp85基因和gp37基因交界位置发生J亚群和E亚群ALV重组现象.本研究证实国内鸡群中存在J亚群和其他亚群ALV的自然重组现象,并表明国内ALV已出现新的变异趋势.     

表达PRRSV E基因重组质粒在小鼠诱导的体液免疫应答

利用 PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) BJ- 4株的 E基因进行修饰和改造 ,在 E基因上游加入 Kozak序列 ,扩增并克隆 E基因。将 E基因 c DNA亚克隆至真核表达载体 pc DNA3.1( )中 ,构建了真核重组表达质粒 pc DNA- E。用pc DNA- E免疫小鼠 ,经免疫荧光抗体试验检测结果表明 ,重组质粒 pc DNA- E经 3次免疫后 ,所有小鼠血清抗体均为阳性 ,说明pc DNA- E在小鼠体内可诱导特异性的体液免疫应答反应。     

马传染性贫血病毒疫苗株EIAV_(FDDV)穿膜蛋白GP45的截短突变

为研究中国马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗致弱过程中基因组的进化特征,作者对EIAVFDDV前病毒的囊膜基因env进行了分析。使用PCR方法体外扩增EIAVFDDV前病毒DNA的env,并随机挑取PCR的阳性克隆子进行测序和序列比对分析。结果表明,随机挑取的PCR阳性克隆中,29/30的克隆子在第2 128-2 130位核苷酸处存在TGG→TGA(翻译中止密码)的突变。该基因对应的EIAV穿膜蛋白gp45的氨基酸数在突变株中较未截短株中减少154,变成259个aa。对EIAVFDDV进行Western blot分析时发现,EIAVDLV45 ku的gp45条带被约35 ku的条带取代。由此推测,EIAVFDDV疫苗株绝大多数病毒颗粒的gp45是截短型。对该代次疫苗株免疫马匹第15和40天体内EIAV前病毒DNA和基因组RNA的序列进行分析,结果表明该截短毒株具有在体内和体外进行复制的能力。由于已有研究表明细胞嗜性改变与gp45的截短有关,因此,推断EIAVFDDV的gp45的截短是其适应在体外培养的驴胎皮肤细胞上复制传代的结果。综上所述,本研究发现EIAVFDDV的gp45存在高比例截短突变,证明该截短突变毒株具有在体内和体外进行复制的能力。但该截短突变是否可通过改变EIAVFDDV在免疫马体内的细胞嗜性,进而影响其毒力和免疫原性,还有待进一步验证。     

编码EIAV核输出因子蛋白Rev的cDNA克隆和序列测定

EIAV在繁殖过程中涉及到多种转录因子的调节，其中Rev蛋白是病毒编码的转录后调节因子，决定了病毒复制由早期到晚期的过渡，Rev是非结构蛋白，由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用EIAV疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物，在病毒增殖早期提取总RNA，反转录后使用EIAV特异引物扩增病毒基因组拼接产物，将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析，通过与基因组全序列的比较，确定了编码Rev蛋白的病毒基因组转录产物的编码序列和拼接位点。