植物木质素生物合成转录因子及调控遗传网络分析

利用生物信息学的方法,对有代表性的23个调控植物木质素生物合成的转录因子进行系统发育树和保守基序分析,同时结合已报道的转录因子功能,构建维管植物次生细胞壁生物合成的调控遗传网络。结果表明:系统发育树中MYB转录因子、NAC转录因子和NtLIM转录因子各聚为一类。保守基序中除PttMYB21a外,MYB转录因子都具有2个不相同的MYB DNA结合域SANT基序;NAC转录因子都具有共同的保守基序NAM。调控遗传网络中11个转录调控模块通过调控自身/下游转录因子/包含AC元件的木质素单体途径基因/不包含AC元件的木质素单体途径基因对次生细胞壁生物合成产生影响。     

刚毛柽柳NAC24基因的表达及抗逆功能分析

【目的】NAC类转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育过程,并在植物响应盐、干旱等多种非生物胁迫的过程中发挥至关重要的调控作用。本研究拟从盐生木本植物刚毛柽柳中克隆获得一个NAC转录因子基因,研究该基因的耐盐、抗旱功能,以期为研究木本植物NAC转录因子的抗逆分子机制奠定理论基础。【方法】在刚毛柽柳NaHCO_3胁迫转录组数据库中筛选获得一个NAC转录因子基因,将其命名为ThNAC24(GenBank登陆号:KF031949)。利用生物信息学工具将其与其他9个物种的NAC蛋白进行多序列比对,与拟南芥105个NAC蛋白进行进化树分析。分别用300 mmol·L^-1 NaCl和400 mmol·L^-1甘露醇对刚毛柽柳进行胁迫,在胁迫6、12、24和48 h后分别取刚毛柽柳根及叶组织。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析盐、干旱胁迫下ThNAC24基因在不同胁迫时间点及不同组织的表达情况,初步鉴定其是否响应盐、干旱胁迫。为进一步研究ThNAC24基因的抗逆功能,分别构建植物过表达(pROKⅡ-ThNAC24)及抑制表达(pFGC5941-ThNAC24)载体。利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系获得ThNAC24基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE)及对照(Control)刚毛柽柳植株。在盐、干旱胁迫下分析比较了ThNAC24基因瞬时过表达、抑制表达及对照刚毛柽柳植株的二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色情况,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,及电解质渗透率、失水率及丙二醛(MDA)含量,鉴定ThNAC24基因的耐盐、抗旱功能。【结果】ThNAC24基因的开放阅读框为1 023 bp,编码340个氨基酸。多序列比对结果显示ThNAC24在N端的氨基酸序列相似度比较高,具有NAC家族的序列特征;系统进化树分析结果显示ThNAC24与ANAC103和ANAC082的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:盐胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫12 h表达量最高,而叶组织中胁迫24 h的表达量最高;干旱胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫6 h表达量最高,在叶组织中胁迫12 h的表达量最高。ThNAC24基因在刚毛柽柳根和叶组织中均有表达且响应盐和干旱胁迫。过表达ThNAC24基因显著降低了刚毛柽柳H_2O_2和超氧阴离子含量,增强了POD和SOD酶的活性,从而减少活性氧(ROS)的积累。过表达ThNAC24基因能够降低刚毛柽柳在逆境胁迫下的电解质渗透率、失水率及MDA的积累,从而保护细胞膜结构的完整性。【结论】刚毛柽柳ThNAC24基因能够响应盐、干旱胁迫,过表达ThNAC24基因植株通过增强POD和SOD活性,进而提高ROS清除能力,减少细胞受损或死亡,从而提高刚毛柽柳的耐盐及抗旱能力。     

杨树维管组织特异启动子的克隆与启动活性分析

启动子在基因表达调控中起关键性作用,它在很大程度上决定所控基因表达的时间、空间和强度。依据拟南芥ATH1芯片分析杨树维管形成时期特异表达基因的结果,选取了差异表达基因NST3,通过BLAST比对在杨树EST数据库(PopulusDB)中找到同源性较高的基因NAC068。以毛白杨为材料,在其基因组中克隆得到该基因5'侧翼区901 bp长的片段,命名为pProNAC068,将该片段置换pBI121载体中的CaMV35S启动子,并在84K杨中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现:该启动子可以控制外源基因在次生维管组织中特异表达,从而为基因工程中有目的的控制外源基因在维管组织中的表达奠定基础。     

重金属胁迫下白骨壤数字基因表达谱分析

[目的]从转录组水平研究重金属污水胁迫处理下白骨壤的基因表达变化,以揭示白骨壤响应重金属污染胁迫的机制。[方法]采用基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)技术对重金属污水胁迫处理组和对照组白骨壤材料进行转录组测序分析。[结果]与对照组相比,重金属处理下白骨壤共有10 459个差异表达基因,其中,8 685个表达量上升,1 774个表达量下降。Me V聚类表明:大部分基因在重金属处理样本中的表达量受到极大的诱导。GO功能注释发现,差异表达基因主要定位于叶绿体以及细胞内各种膜结构,参与"细胞代谢"、"细胞组分的组合和生物合成"、"对刺激的响应"等过程。KEGG代谢通路分析显示,差异表达基因分布于126条Pathways,涉及"核糖体"、"光合作用"、"乙醛酸盐代谢"、"丙酮酸代谢"等途径。重金属胁迫还促进萜类、黄酮类化合物生物合成的关键酶基因(牻牛儿基焦磷酸合酶(0009238)、黄酮醇合成酶(0001833))的表达,进而促进白骨壤有效成分的积累;显著诱导细胞分裂素水解酶编码基因CKX7(0057124)、油菜素内脂信号转导组分基因BSK(0043741)等的表达,进而提高白骨壤对重金属胁迫的适应能力。此外,转录因子分析发现,b HLH、NAC、MYB-related和WRKY在重金属胁迫中发挥重要作用。实验选取8个与环境刺激响应密切相关的基因,通过qRT-PCR验证了它们在重金属污水胁迫处理下的表达差异,结果与数字基因表达谱分析的结果较一致,证实了差异表达基因数据的有效性。[结论]重金属处理影响了白骨壤大量的新陈代谢、光合作用、小分子酸合成、激素合成与信号转导及次生代谢产物合成相关基因的表达。