CXCR2基因与奶牛乳房炎

CXCR 2基因是目前定位于牛2号常染色体上的与奶牛乳房炎有关的基因,CXCR 2是趋化因子CXC类的受体之一,它能介导趋化因子趋化免疫细胞定向迁移使机体产生免疫应答。奶牛乳房炎是奶牛业中常见的难以治疗的疾病,目前科学家正试图从遗传角度对其进行遗传控制。     

奶牛TLR2基因遗传变异与乳房炎体细胞评分的相关研究

选用中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛共207头奶牛为研究对象,采用PCR-RFLP和创造酶切位点RFLP（CRS-RFLP）技术对其TLR2基因进行多态性研究,发现TLR2基因第2外显子上T/G,G/A和G/A 3个突变,分别是EcoRⅤ,HaeⅢ和HhaⅠ限制性内切酶的酶切多态位点,其中T/G突变引起蛋白质氨基酸天冬氨酸/谷氨酸的变化。对3个酶切多态位点进行基因型分析,χ^2检验表明：中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛在3个酶切多态位点都达到了Hardy-Weinberg平衡。中国西门塔尔牛在3个酶切多态位点PIC为最高。运用SAS9.0软件,采用最小二乘拟合一般线性模型分析了3个酶切多态位点与中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛体细胞评分（SCS）的关系,结果表明：在这3个酶切多态位点中,只有EcoRⅤ酶切多态位点BB基因型个体的SCS显著低于AA和AB基因型个体（P〈0.05）,说明BB基因型可能为抵御乳房炎的有利基因型。     

奶牛TLR2基因EcoR V酶切多态性与体细胞评分的关联分析

利用PCR-RFLP技术对中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛3个奶牛品种207头个体的TLR2基因进行多态性分析.结果表明：3个奶牛群体的扩增片段为448 bp,PCR产物经限制性内切酶EcoRV酶切后均表现出中度多态,其中中国西门塔尔牛PIC为最高,且3个奶牛品种在该基因座位均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）.最小二乘值表明：该酶切多态位点对3个奶牛品种SCS的影响达到了显著水平（P＜0.05）,且BB基因型个体的SCS显著低于AA和AB基因型个体（P＜0.05）,说明BB基因型为抗乳房炎的有利基因型.     

CXCR2基因多态性与奶牛体细胞评分的关联性

利用基因测序技术对CXCR2基因进行了多态性筛查,结果发现存在+612A→G、+684G→A、+777G→C、+855G→A、+858C→A和+861G→A等6个突变位点,其中+855为新发现的SNP。6个位点都处于连锁不平衡状态,+684与+861位点之间和+777与+858之间的相关程度高(r2分别为0.635和0.541)。基因效应模型分析表明:+855和+861位点不同基因型对奶牛体细胞评分的影响没有显著性差异(P0.05)。+612位点不同基因型对体细胞评分的影响具有显著性差异(P0.05),AA基因型个体的体细胞评分最低为4.19,乳房炎抗性最强。+777位点不同基因型对体细胞评分的影响差异性显著(P0.05),GG基因型个体体细胞评分最低为4.17,对乳房炎的抗性较强,说明该基因+612和+777SNPs可作为奶牛乳房炎抗性分子标记位点。     

奶牛TLR2基因EcoRⅤ酶切多态性与体细胞评分的关联分析

利用PCR-RFLP技术对中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛3个奶牛品种207头个体的TLR2基因进行多态性分析。结果表明:3个奶牛群体的扩增片段为448bp,PCR产物经限制性内切酶EcoRⅤ酶切后均表现出中度多态,其中中国西门塔尔牛PIC为最高,且3个奶牛品种在该基因座位均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。最小二乘值表明:该酶切多态位点对3个奶牛品种SCS的影响达到了显著水平(P<0.05),且BB基因型个体的SCS显著低于AA和AB基因型个体(P<0.05),说明BB基因型为抗乳房炎的有利基因型。     

奶牛乳房炎抗性候选基因的研究进展

近年来,随着生物信息学和分子育种技术的发展,对乳房炎抗性候选基因的研究成为抗病育种的新热点。本文综述了牛淋巴细胞抗原基因、ToLL样受体家族基因、牛乳铁蛋白基因、DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位基因、牛锌指蛋白313基因的研究现状。     

金黄色葡萄球菌基因分型方法研究进展

金黄色葡萄球菌是引起医院和社区感染的重要致病菌之一,也是引起奶牛乳房炎的重要致病菌。为有效控制其感染及流行,并为临床采取控制措施提供理论依据,需要对菌株进行分型。本文就金黄色葡萄球菌的基因分型方法研究进展作一综述。     

奶牛乳房炎样品金黄色葡萄球菌分离株的基因分型

为了掌握上海地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌基因型,本文采用ERIC-PCR分型方法,对从患有乳腺炎的奶牛乳汁中分离所得的74株金黄色葡萄球菌进行了基因分型。结果显示,74株金黄色葡萄球菌可扩增出4~9条带,共分为4个聚类群,亲缘关系相同或相近的菌株占97.7%。发现在同一牛群中的分离株可以是相同的基因型,也可以存在不同的基因型,而不同牛群中的分离株也可属于同一基因型。但总的来说,上海地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌多为同一基因型,在某个或某些牛群中存在金黄色葡萄球菌的优势基因型,而不同地区、不同环境和条件下同一种病原菌的基因型也存在一定差异,可能存在多个金黄色葡萄球菌基因型。     

辽宁地区奶牛乳房炎源大肠杆菌毒力基因及耐药基因检测分析

为了掌握辽宁地区规模奶牛场乳房炎源大肠杆菌携带的毒力基因和耐药基因,为奶牛养殖业提供更好的乳房炎防制方案,本研究采用PCR检测方法对辽宁地区多个规模奶牛场临床奶牛乳房炎奶样中分离的66株大肠杆菌进行了4种毒力基因和4种耐药基因的检测分析。结果发现,66株大肠杆菌中仅有1株未检出相关目的基因,其余65株中最少检出2种目的基因,最多检出7种目的基因。其中,毒力基因stx2e、eaeA、K99和astA的检出率分别为56.1%、47.0%、34.8%和31.8%,双重毒力基因的检出率达到43.9%,以eaeA/stx2e基因型的检出率最高;耐药基因sul3、sul1、cmlA及aacA4的检出率分别为87.9%、83.3%、40.9%和28.8%,双重耐药基因的检出率为36.4%,以sul1/sul3基因型检出率最高;三重耐药基因的检出率为37.9%,以cmlA/sul1/sul3检出率最高。本研究结果证实,辽宁地区奶牛乳房炎源大肠杆菌携带磺胺类耐药基因和氯霉素类耐药基因的比率较高,与大肠杆菌的耐药性有较直接的关系,该结果对于辽宁地区奶牛乳房炎的防制具有重要的指导意义,更具有重要的公共卫生意义。     

奶牛乳房炎克雷伯氏菌的基因分型

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对内蒙地区37株奶牛乳房炎克雷伯氏菌进行了基因分型。试验结果表明：利用引物（P1）将37株菌分7个基因型，37株的56．8％（21／37）是同一个基因型。本结果对克雷伯氏菌性乳房炎的防治研究有重要的参考意义。     

奶牛乳铁蛋白基因多态性及其与乳房炎关系的研究进展

简述了奶牛乳钛蛋白基因的结构、功能、多态性的一般特性，并且介绍了bLF基因与乳房炎的关系。     

奶牛外周血树突状细胞体外诱导培养与鉴定

通过粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)体外诱导外周血单核细胞为树突状细胞,为利用树突状细胞免疫疗法治疗奶牛乳房炎奠定基础和提供细胞模型。利用淋巴细胞分离液分离获得奶牛外周血单核细胞,在6孔板内培养2 h后,弃掉含有大量的T细胞和B细胞上清液,贴壁的基本上是单核细胞,磷酸盐缓冲液清洗5次,加入含有GM-CSF和IL-4的2 m L培养基进行3 d诱导。之后,从培养基顶部小心吸弃1.4 m L的培养基,然后再补加含有GM-CSF和IL-4的1.8 m L培养基继续诱导3 d。每天通过显微镜观察细胞形态。第7天经流式检测细胞表面抗原CD11c、CD14、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)、CD40、CD80、CD86的表达。结果表明:1)第2天,一些细胞表面可以生长出刺突并伴随着伪足的生长。第3天,细胞表面的刺突和伪足越来越多。第4、5天,一些带有刺突和伪足的细胞开始聚集和融合。第6天,单核细胞基本被诱导为树突状细胞,细胞表面含有大量清晰可见的刺突和伪足。2)经流式检测,CD14、CD11c、MHCⅡ阳性表达细胞分别占诱导细胞的6.8%、65.0%、75.9%,CD80和CD86阳性表达细胞分别占诱导细胞的2.0%和1.2%。综上所述,采用奶牛外周血单核细胞经体外诱导能够获得一定纯度的奶牛树突状细胞。     

内蒙古地区奶牛乳房炎链球菌毒力基因检测及耐药性研究

为了解内蒙古地区奶牛乳房炎链球菌毒力基因的分布情况及其耐药现状,通过该地区360份乳房炎奶样链球菌的分离鉴定,利用微量肉汤稀释法测定了81株链球菌对15种药物的MIC,采用PCR法检测耐药基因及毒力基因的携带情况。结果显示,分离到的81株链球菌对β-内酰胺类的耐药率最高;对红霉素和四环素的耐药率在40%~85%;对氟喹诺酮类的耐药率相对较低。多重耐药菌株达88.9%(n=72)。耐药基因pbp2b的检出率为86.4%,tetL和tetM的检出率在75%以上,红霉素耐药表型主要由ermB介导。分离菌株毒力基因中cfb的检出率最高(50.6%),其次为cyl和hylB。内蒙古地区奶牛乳房炎链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类和四环素耐药情况严重,且发现多重耐药菌株的流行;链球菌中尤以无乳链球菌的毒力基因携带率较高。     

奶牛乳房炎葡萄球菌菌种的鉴定及其mecA基因与耐药性关系分析

从209份奶牛乳房炎阳性乳样分离葡萄球菌,用PCR扩增Tuf和16S rRNA基因片段,根据序列同源性进行种的鉴定,用PCR检测mecA基因,用标准方法进行药敏试验。结果显示,分离的104株葡萄球菌分为14个种,包括金黄色葡萄球菌和13种凝固酶阴性葡萄球菌,后者主要为阿氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌和产色葡萄球菌,不同于国外的研究报道;松鼠葡萄球菌和溶血葡萄球菌的mecA基因检出率高达66.7%,表皮葡萄球菌达42.9%,金黄色葡萄球菌达35.7%,显著高于国内外报道;大部分葡萄球菌的β-内酰胺类抗生素耐药性与mecA基因检测不相符,可能与其他mec基因有关。     

牛源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及ClfA基因的克隆和真核表达载体的构建

以研制安全有效的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程疫苗为目的,采集380份隐性和临床型乳房炎奶样,经高盐肉汤、过氧化氢酶、甘露醇发酵、三糖铁发酵试验以及Baird-Parker平板对金黄色葡萄球菌进行分离和生化鉴定,PCR扩增分离株凝集因子基因(Clf A)并连接TA克隆载体。经测序确定无误后,连接pc DNA3.1His B以构建真核表达载体pc DNA 3.1His B-Clf A,转化Trans T1TM感受态细胞,HindⅢ和XhoⅠ双酶切分析,同时进行测序和序列分析。结果显示,通过高盐肉汤、过氧化氢酶、甘露醇、三糖铁试验和Baird-Parker平板从380份隐性及临床型奶牛乳房炎奶样中共分离到35株金黄色葡萄球菌,成功构建了真核表达载体(pc DNA3.1His B-Clf A),为研制金黄色葡萄球菌基因工程疫苗奠定基础。     

江苏地区奶牛乳房炎凝固酶阴性葡萄球菌耐药基因分析

对江苏地区多个奶牛场采样,并对奶牛乳房炎(Bovine mastitis,BMT)检测阳性奶样进行病原菌分离、鉴定。对分离出的凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococci,CNS)分别进行20种药物的敏感性试验和相关耐药基因检测。结果显示,BMT检测阳性的奶样有610份,528份检出细菌,共检出细菌802株,鉴定为CNS的217株;大部分CNS对万古霉素、左氟沙星、氯霉素、磷霉素、呋喃妥因敏感,对青霉素、大观霉素具有较强耐药性;CNS对β-内酰胺类(blaZ)、大环内酯类(ermC)和四环素类(tetK、tetM、tetL、tetO)耐药基因的检出率分别为29.95%、2.30%、24.88%、1.84%、1.84%和0.00%。     

"乳康2号"对奶牛细菌性乳房炎的疗效研究

用＂乳康2号＂治疗临床型乳房炎奶牛37头。结果表明,治愈28头,有效6头,无效3头,总有效率为91.89%,平均治疗时间4.7d。对采集的37头奶牛治疗前的42个乳区奶样,进行细菌学检查,有33个乳区检出与乳房炎有关的病原菌,占78.57%。检出病原菌5种,主要为无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌和大肠埃希菌。停药后采集33个乳区奶样,结果有14个乳区细菌转阴,细菌转阴率为42.42%。在转阴的病原菌中,大肠埃希菌转阴率最高（100%）,其次是混合感染（60.00%）和乳房链球菌（50.00%）。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及毒力基因检测

为研究奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力基因的分布情况,本试验通过MALDI Biotyper系统对分离自3个奶牛场的25株金黄色葡萄球菌进行鉴定及聚类分析,并采用PCR方法对25株金黄色葡萄球菌的nuc、clfA、fnbA、fn-bB、tsst-1、sea、seb和sec等14种毒力基因进行检测。结果显示,25株金黄色葡萄球菌被分为3个类群,各个类群之间及类群内菌株遗传距离较远。14种毒力基因中有7种被检出,检出率分别是nuc(100%)、fnbA (100%)、seg(64%)、clfA(52%)、fnbB(32%)、tsst-1(16%)和sea(4%),其余未检出。结果表明,不同奶牛场甚至同一奶牛场内存在多种金黄色葡萄球菌的流行株,且金黄色葡萄球菌携带毒力基因的数量和种类不同,并存在多种毒力基因组合,为奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的防治提供基础研究。     

敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SQLE）基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降（P<0.05）,细胞增殖受到极显著抑制（P<0.01）;G1期细胞数量显著下降（P<0.05）,G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升（P<0.05）;肿瘤坏死因子超家族成员6（又称Fas或CD5）的相对表达量显著上升（P<0.05）,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27）相对表达量显著上升（P<0.05）,而细胞周期素D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤因子2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax）显著下降（P<0.05）。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。     

乳房链球菌对克林霉素耐药基因的定位

采用试管稀释法和纸片法测定9株乳房链球菌对克林霉素的耐药性，通过PCR反应检测克林霉素的耐药性基因，并进行测序比较。发现克林霉素对乳房链球菌的抗菌活力较强，克林霉素耐药基因同时存在于乳房链球菌的染色体和质粒上。