野生红花隔距兰根部内生真菌研究

为了解内生真菌在红花隔距兰根部的种类多样性以及受生境的影响,采用组织培养法,对海南霸王岭地区不同生境下的野生红花隔距兰根部进行内生真菌分离与鉴定.结果共分离到内生真菌145株,确定为15属,其中子囊菌门的Penicillium 16株,Aspergillus 12株、Pestalotiopsis5株、Fusarium 19株、Neonectria 2株、Chaetomium 4株、Calonectria 5株、Xylaria 5株,半知菌类的Paecilomyces 7株、Alternaria 2株、Phomopsis 8株、Colletotrichum 32株,接合菌门的Rhizopus5株、Mucor 7株,卵菌门的Albugo 6株,有10株菌经ITS序列比对分别与Botryosphaeria sp.、Beltraniella sp.相似度较低,有待进一步鉴定研究确定其分类地位.发现Colletotrichum sp.、Penicillium sp.、Fusarium sp.为优势真菌,生在于热带针叶林的植株根部分得的内生真菌最多,生物多样性最丰富.     

云南几种兰花菌根真菌的分离鉴定

从采自云南昆明的墨兰,文山红竹兰、大雪素、小雪素、惠兰、春绿兰以及采自丽江、保山的小雪素根中分离到12株真菌。通过培养性状、ITS序列分析鉴定得出分离菌株分别属于镰刀菌属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、格孢腔菌属(Pleospora)、毛壳菌属(Choetarnium)、柱孢属(Cylindrocarpon sp.)。本文首次从采自云南的大雪素和小雪素中分离兰花菌根真菌。从墨兰中分离到格孢腔菌属(Pleospora)真菌在国内未见报道。     

灯盏花内生真菌分离及其产黄酮内生真菌的初步研究

【目的】本研究对昆明市寻甸县人工栽培的大田灯盏花的根、茎、叶、花的内生真菌进行分离鉴定,旨在筛选产黄酮的内生真菌菌株。【方法】采用纯培养方法分离植物内生真菌,利用形态鉴定及显色反应筛选产黄酮内生真菌。【结果】共获得内生真菌40株,经显微形态观察40株内生真菌初步分类鉴定为14个属。通过黄酮类物质特异颜色反应,筛选到7株内生真菌产黄酮类物质,这7株内生真菌经初步鉴定为交链孢属(Alternaria sp.)、镰孢霉属(Fusarium sp.)、痕格孢属(Sirosporium sp.),根中内生菌产黄酮最高质量浓度为2.625 mg/L。【结论】灯盏花不同部位内生真菌的数量、分布和种群存有差异性,从根部分离到的内生真菌产黄酮类质量浓度最高。     

西藏3种疯草中合成苦马豆素内生真菌的鉴定

 【目的】从西藏毛瓣棘豆、冰川棘豆、茎直黄芪中分离内生真菌。【方法】应用薄层色谱法、气相色谱、气相色谱-质谱联用法检测内生真菌中的苦马豆素（swainsonine,SW）,筛选可生成SW的内生真菌;应用聚合酶链反应对真菌的ITS序列和IGS序列进行扩增,并根据ITS序列信息构建系统发育树,确定其种属分类;对IGS序列进行限制性酶切,并分析酶切产物。【结果】从3种疯草中分离到可以产生SW的4株内生真菌,各菌的形态、ITS序列的同源性与埃里格孢属真菌较为接近,系统发育分析表明4株真菌均为棘豆埃里格孢菌。ITS序列和IGS序列的限制性片段的分析表明,4株真菌遗传距离较近,但仍存在种间变异,可能为棘豆埃里格孢菌的不同亚种。【结论】本研究结果为探讨内生真菌合成SW机理研究奠定了基础,为动物疯草中毒病的防除和疯草资源的合理利用提供了新思路。     

宁夏苦豆子中产苦参碱内生真菌的分离与鉴定

【目的】从宁夏野生苦豆子中分离内生真菌,筛选能够产生苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱或槐定碱4种喹诺里西啶类生物碱的内生真菌。【方法】应用光学显微镜和扫描电子显微镜对分离菌株显微形态进行观察,根据形态对各菌株进行初步分类;应用薄层色谱法、气相色谱-质谱联用法和酸性染料比色法检测各分离菌株的生物碱成分。对能够产生生物碱的真菌ITS和SSU rDNA序列进行扩增和测序,根据序列信息进行同源性比较和系统发育树构建;结合形态特征,对其进行种属分类。【结果】从苦豆子中共分离到27株真菌,其中23株分属于青霉属、曲霉属、链格孢属、镰刀菌属、Simplicillium属真菌,4株为不产孢菌;筛选出E1、E3和E5这3株能够产生苦参碱的内生真菌,均属于Simplicillium属真菌,其菌丝中苦参碱的含量分别为20.4、17.4和37.6 μg•g-1。【结论】根据真菌形态特征、同源性比较和遗传进化分析结果,确定该3株产苦参碱内生真菌均为Simplicillium lanosoniveum。     

中国兰属植物菌根真菌的rDNA ITS分析

【目的】对30株中国兰属植物菌根真菌进行分子鉴定及遗传多样性分析,进一步探讨中国兰属植物与其菌根真菌的专一性。【方法】以真菌通用引物ITS1/ITS4,扩增分离自云南6种兰属植物的30株菌根真菌的rD-NA ITS序列,再与GenBank中的菌株rDNA ITS序列进行Blast比对,并采用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。【结果】rDNA ITS序列Blast比对结果显示,分离的30株菌根真菌分别隶属于镰刀菌属、毛壳菌属、柱孢霉属和瘤菌根菌属,与形态学鉴定结果一致;菌根真菌ITS1-5.8S-ITS2序列总长429～563bp,GC含量为41.67%～58.06%,其中ITS1长92～259bp,GC含量为47.66%～58.62%;5.8S长155～158bp,GC含量为40.81%～52.05%;ITS2长146～192bp,GC含量为38.78%～55.56%;聚类分析显示,30株菌根真菌可分为4组,其中,分离自送春、蕙兰、建兰的菌根真菌皆属于镰刀菌属,聚在Ⅰ组上;分离自春剑的菌根真菌除CJ7单独聚在Ⅳ组外,其他均聚在Ⅰ组上;分离自莲瓣兰、春兰的菌根真菌分别聚在Ⅱ和Ⅲ与Ⅰ和Ⅱ2个分支上,分离自莲瓣兰的菌根真菌聚在Ⅱ、Ⅲ2个分支上。【结论】在供试的6种兰属植物中,春剑、春兰、莲瓣兰和蕙兰菌根真菌的遗传多样性较送春、建兰丰富;蕙兰、送春、建兰与菌根真菌的专一性较强,而春剑、春兰、莲瓣兰与菌根真菌的专一性相对较弱。     

三尖杉内生真菌的遗传多样性研究

本研究以三尖杉的根、茎、叶中分离的91株内生真菌为材料,根据其菌落颜色、质地、生长速率和分生孢子外观等形态学特征,确定了其中74株产孢内生真菌为5个属.采用特异性PCR对91株菌株的ITS片段进行扩增,获得单一的分子长为600bp的条带,以4种限制性内切酶对扩增的ITS片段进行RFLP分析,并对部分ITS碱基序列进行测定,表明三尖杉内生真菌的属和种丰富,其中的优势属为刺盘孢属、曲霉属及小丛壳属,表现为热带真菌类型;小丛壳属是首次从三尖杉科植物中分离.本研究结果提示三尖杉内生真菌有丰富的遗传多样性.     

兔眼蓝莓幼果内生真菌多样性及其抑菌活性鉴定

采用组织分离法和对峙培养法研究兔眼蓝莓幼果内生真菌多样性及其对6种植物病原真菌的拮抗作用,筛选具有抑菌作用的内生真菌。结果表明：从兔眼蓝莓幼果中共分离得到25株内生真菌,利用菌株rDNA−ITS序列进行blastn比对,将25株菌株划分为12属19种,相似度为97%～100%。其中,子囊菌门真菌共9属14种共20株,担子菌门有3属5种。间座壳属真菌为子囊菌门菌株的优势属,占子囊菌门菌株的25%。兔眼蓝莓幼果内生真菌Shannon−Wiener多样性指数（H）为2.2870,Pielou均匀度指数（J）为0.9203,Margalef丰富度指数（R）为3.4173。在25株兔眼蓝莓幼果内生真菌中,裂褶菌属菌株G6对5种病原菌抑制率在40%以上,G18对4种病原菌抑制率在45%以上,抑制效果较好。     

1株产白藜芦醇及白藜芦醇苷虎杖内生真菌的分离鉴定

对秦岭山区虎杖内生真菌进行分离、纯化及摇瓶发酵,通过对其发酵液及菌丝的乙酸乙酯萃取液进行HPLC分析,获得1株既产白藜芦醇又产白藜芦醇苷的菌株,产量均在4 mg/L以上.根据该菌株的形态特征及菌丝ITS序列分析,将该株菌确定为半知菌亚门丛梗孢目丛梗孢科青霉属(Penicillium sp.)真菌.     

大花杓兰内生真菌多样性研究

对大花杓兰(Cypripedium macranthum Sw.)内生真菌类群组成及多样性进行了分析。结果表明,从大花杓兰植株中分离到内生真菌59株,利用ITS-r DNA序列分子鉴定法将大花杓兰内生真菌鉴定为18个分类单元,分布在7纲9目11科16属。北京大花杓兰内生真菌包括12个属,内生真菌的多样性指数H=1.39、D=0.96,优势菌群为毛壳菌属(Chaetomium)和茎点霉属(Phoma)真菌,分别占总菌株数的15.25%和8.47%;吉林大花杓兰样品内生真菌归于9个属,内生真菌的多样性指数H=1.31、D=0.93,以毛壳菌属(Chaetomium)为优势菌群,占总菌株数的23.73%。由此可见,北京大花杓兰中内生真菌多样性高于吉林大花杓兰。     

禾谷丝核菌拮抗真菌的鉴定及抗菌活性研究

利用从小麦茎叶组织中分离的内生真菌,进行平板对峙试验,从中筛选出2株对禾谷丝核菌有明显抑制效果的菌株(RF5和RF6)。采用改良的真菌基因组DNA提取方法,提取内生真菌RF5和RF6的基因组DNA,运用ITS序列通用引物(ITS4、ITS5)进行扩增,分别得到约600 bp的特异条带。对PCR产物进行测序,根据序列比对分析结果,将拮抗真菌RF5和RF6分别鉴定为:肉座菌(Hypoc-reales sp.)和杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。进一步研究这2株拮抗真菌的抗菌活性大小,结果显示,2株真菌对病原菌都能产生明显的抑菌圈,抑菌圈直径分别为23 mm和19 mm;其液体发酵产物对病原菌的生长也有显著抑制作用,抑制率分别为63.3%和60.8%。     

植物内生菌及其防治植物病害的研究进展

目的了解香竹箐栽培古茶树内生真菌对植物病原真菌的拮抗活性。方法采用尖端菌丝纯化法分离内生真菌,并结合形态学和分子生物学方法对内生真菌进行鉴定,采用五点对峙培养法筛选对供试病原真菌具有拮抗活性的内生真菌菌株,对具有较强活性的菌株进行分类地位归属。结果从香竹箐栽培古茶树枝叶中共分离纯化出308株内生真菌,归属于61个形态型。病原真菌拮抗试验结果显示：有18株内生真菌对4种以上供试菌的抑制率大于50%,分别隶属于2门3纲10目13科14属。有13株对至少1种供试菌的抑制率大于75%,有9株对5种供试菌的抑制率均大于50%。其中,菌株Ct-BC40、Ct-BC72和Ct-LP113对5种供试菌的抑制率达80%以上,属强拮抗菌株。结论香竹箐栽培古茶树内生真菌中广泛分布着抑菌活性菌株,占分离菌株总数的96%以上,且抗菌活性、种属分布具有多样性。     

铁皮石斛促生内生真菌的筛选与鉴定

从铁皮石斛根中分离得到37株内生真菌,经过与组培苗共生筛选,获得9株促生菌,其中3株真菌对铁皮石斛的鲜质量增长率、根数增长率和芽数的促生效果最好。采用形态学观察和ITS序列测定相结合的方法对这9株促生菌进行鉴定。经形态学观察,初步鉴定出2株,均为瘤菌根菌属。根据rDNAITS序列分析显示,2株与Epulorhizasp．的相似性分别为100％和96％,1株与Guignardiacamelliae的相似性达100％,1株与MycosphaereUacruenta的相似性为99％。另外5株促生真菌分类地位尚不能确定,但这5株菌株与登录号为EU482263、GQ996178、AM901831、GU566294和GU566256的序列相似性分别达96％、95％、99％、98％和100％。     

黄精根腐病分离菌及其拮抗内生细菌的鉴定

黄精是重要的药食同源植物。采集湖南洪江市发生的黄精根腐病株,从其分离菌株HF2的培养性状和形态学特征、真菌rDNA内转录区(ITS)、EF-1a区序列分析和系统发育关系比较等方面对该菌株进行了鉴定;通过平板对峙试验筛选对黄精根腐病菌具有抑制作用的内生细菌,并进行形态观察、生理生化指标测定和16S rRNA序列分析。结果表明:从根腐病株中分离得到的菌株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum);从黄精中分离获得40株内生细菌,对尖孢镰刀菌有抑制作用的菌株10株,其中A8的抑菌效果最好,对病原菌的抑菌圈半径可达13 mm,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

驱杀菜青虫的内生菌鉴定与化合物研究

为了寻找新型驱杀菜青虫的菌种,对大戟科植物内生真菌进行筛选。发现内生菌B6具有很好的驱杀菜青虫的能力,发酵液处理的菜叶对菜青虫校正死亡率达到60.86%。发酵液正丁醇提取物对菜青虫校正死亡率达到42.44%,在薄版层析上呈现3个斑点。发酵液和菌丝均呈浓郁的香味,从菌丝乙酸乙酯提取物中,鉴定出乙酸、乙酸丙酯和3-甲基-2-酮基戊酸甲酯3种成分。对该菌16SrDNAITS序列进行测序,结合形态鉴定确定该菌属于角担子菌属真菌Ceratobasidum stevensii。     

珙桐产黄酮内生真菌的分离和鉴定

采用珙桐(Davidia involucrata Baill.)组织分离产活性物质的内生真菌,以金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌为测试细菌进行内生真菌代谢物对细菌的抑制实验,用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析内生真菌的活性物质成分。结果表明,从珙桐枝、叶中分离到126株内生真菌,其产物对3种细菌的抑菌率分别为65%、71%、25%,其中D37菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。经HPLC分析证明,菌株D37的次生代谢产物中含有槲皮素、山奈酚2种黄酮类物质,每100 g干菌丝可产黄酮31.9 mg。根据菌株D37的形态学特征,结合核糖体基因居间序列(Internaltranscribed spacer,ITS)的分析结果,确定菌株D37为曲霉属,烟曲霉种(Aspergillus fumigatus)。从珙桐分离的产黄酮内生真菌D37可作为生产黄酮类药物的候选菌株,也为抗生素药物的筛选奠定了基础。     

深圳近海海域产纤维素酶、脂肪酶和漆酶 真菌的筛选及酶学性质分析

现有自深圳海域分离出的真菌31株,其中包括22株丝状真菌和9株酵母菌.对各菌株进行纤维素酶、脂肪酶和漆酶等胞外酶的定性筛选后,进行胞外酶定量分析.结果表明,在定性初筛的培养基生长5d后,大多数菌株呈现出2～3种胞外酶活力的溶解圈,而9个酵母菌菌株都没有检出漆酶活力.在定性测量的结果基础上,挑选出产酶潜力大的2株丝状真菌(PKU F16、PKU F18)和2株酵母菌(PKU Y5、PKU Y8),进行3种胞外酶的定量分析.在各菌株培养4、6、9d时,分别对3种胞外酶活进行测定,结果发现各菌株生产3种胞外酶的定量分析结果与定性分析结果基本吻合,且随着培养时间的增长,菌株的胞外酶活力呈现先增后减的趋势.在第6天,F18和Y8产纤维素酶活力分别高达1.13、1.31 U/min·mL.Y8的脂肪酶活力产量高达21.94 U/min·mL.F18和F16产漆酶活力高达14.61、10.50 U/min· mL.     

产甘草苷内生真菌HGE5的鉴定及抑菌活性研究

[目的]研究甘草内生真菌HGE5及其活性代谢产物,为深入开发利用该菌株提供依据。[方法]选取12种受试致病菌,测定内生真菌HGE5的抑制活性,并采用形态特征观察法及r DNA ITS序列同源性分析对内生真菌HGE5进行鉴定,利用HPLC法对HGE5发酵液进行分析。[结果]甘草内生真菌HGE5对8种受试致病菌有较强的抑菌作用,内生真菌HGE5为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum);该菌发酵液中含有甘草苷。[结论]HGE5是甘草苷产生菌,该菌的获得可为甘草苷成分的生产提供新方法。     

淮稻5号的真菌多样性及其储藏过程中可培养的优势真菌

【目的】从传统形态学和分子生物学两方面对2013年的淮稻5号中分离的真菌进行鉴定,并研究淮稻5号在不同储藏条件下优势菌株的演变规律,为该品种稻谷储藏过程中的真菌种属研究及霉变防控提供参考。【方法】淮稻5号中的可培养真菌通过采用孟加拉红和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）两种培养基,按照国标GB 4789.15-2010的操作获得。将采自4个不同地区的淮稻5号混匀,分别调节其水分含量为14.5%和18.5%后放入25℃人工气候箱内模拟储藏,逐月取出模拟储藏的稻谷样品进行传统培养以确定可培养的优势真菌。真菌的种属分别通过菌落、菌丝及孢子的形态学观察,对照《中国真菌志》等参考文献确定;同时通过PCR分别扩增相应真菌的内转录间隔区（ITS）和28S rDNA的部分序列,连接T载体后测序,通过构建系统发育树进而确定真菌的种属。【结果】从4个地区的2013年淮稻5号稻谷中共分离得到33株真菌,主要为青霉（Penicillium）、曲霉（Aspergillus）和镰刀菌（Fusarium）等菌属,其中青霉属与曲霉属最多,分别为16株和15株,分别占分离所得菌株的48.5%和45.5%,表明青霉和曲霉是2013年淮稻5号稻谷中可培养真菌的优势菌属。而镰刀菌属的真菌仅2株,仅占分离所得菌株的6%。模拟储藏的结果表明,水分含量为14.5%的淮稻5号在25℃条件下储藏6个月时出现优势菌株,为橘灰青霉（Penicillium aurantiogriseum）,并且该优势菌在模拟储藏的第7、8个月持续存在。水分含量为18.5%的淮稻5号在25℃条件下储藏7个月时出现优势菌株,为酵母菌,且该优势菌在模拟储藏8个月时依然存在。【结论】2013年淮稻5号中分离获得33株真菌,主要包括16株青霉、15株曲霉以及2株镰刀菌,表明青霉和曲霉是2013年淮稻5号稻谷中的优势菌属。不同水分含量的稻谷在储藏过程中可能出现不同的优势菌株。