家蚕健康性分子检测的研究(英文)

[目的]探索家蚕体内的热激蛋白表达量与家蚕材料的健康性变化的规律。[方法]利用生物信息学分析方法筛选出具有代表性的家蚕热激蛋白基因(Bmhsp24.3)并对其进行实时定量(RealTimePCR)表达分析。[结果]目的基因Bmhsp24.3在不同家蚕材料中都有所表达,但在不同材料间的表达差异很明显;饲育条件不同,该基因相对表达水平有着不同程度的变化,饲育温度的升高,该基因的表达量都有不同程度的提高,健康性好的材料,目的基因的表达量增加的较多,健康性差的材料,目的基因表达量增加的较少。目的基因Bmhsp24.3在不同材料间的表达差异,刚好与品种的健康性保持一致。[结论]材料的健康性与目的基因Bmhsp24.3表达量存在相关性,目的基因Bmhsp24.3表达量越高,材料的健康性越好;反之,目的基因Bmhsp24.3表达量越低,材料的健康性越差。     

家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式

为探究接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)24与48 h后,家蚕中肠6种丝氨酸蛋白酶基因(serine protease gene, sps)的表达变化趋势,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)方法对正常组和微孢子虫感染试验组的6个家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因(编号分别为sp1、sp3、sp5、sp8、sp11和sp12)进行定量分析.结果显示,与正常家蚕中肠内丝氨酸蛋白酶基因的转录水平相比, sp1、sp3、sp5和sp12在接种家蚕微孢子虫24与48 h后均上调表达,其中sp5上调最明显,接种家蚕微孢子虫24与48 h的表达量分别是对照的1.9和1.2倍;sp8和sp11在受微孢子虫感染24 h后表达上调,而48 h后表达量下降.结果表明,丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)参与了家蚕中肠对微孢子虫入侵的免疫反应;不同丝氨酸蛋白酶上调倍数不同,说明不同丝氨酸蛋白酶参与家蚕免疫反应的程度不同;家蚕微孢子虫侵染48 h后,sp8和sp11出现了下调,推测微孢子虫的成功入侵抑制了sp8和sp11的表达.家蚕中肠不同丝氨酸蛋白酶在微孢子虫感染的不同时间的表达变化趋势为进一步研究丝氨酸蛋白酶家族在家蚕微孢子虫与宿主家蚕互作中的作用奠定了基础.     

家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式

为探究接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)24与48 h后,家蚕中肠6种丝氨酸蛋白酶基因(serineprotease gene,sps)的表达变化趋势,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法对正常组和微孢子虫感染试验组的6个家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因(编号分别为sp1、sp3、sp5、sp8、sp11和sp12)进行定量分析。结果显示,与正常家蚕中肠内丝氨酸蛋白酶基因的转录水平相比,sp1、sp3、sp5和sp12在接种家蚕微孢子虫24与48 h后均上调表达,其中sp5上调最明显,接种家蚕微孢子虫24与48 h的表达量分别是对照的1.9和1.2倍;sp8和sp11在受微孢子虫感染24 h后表达上调,而48 h后表达量下降。结果表明,丝氨酸蛋白酶(serineprotease,SP)参与了家蚕中肠对微孢子虫入侵的免疫反应;不同丝氨酸蛋白酶上调倍数不同,说明不同丝氨酸蛋白酶参与家蚕免疫反应的程度不同;家蚕微孢子虫侵染48 h后,sp8和sp11出现了下调,推测微孢子虫的成功入侵抑制了sp8和sp11的表达。家蚕中肠不同丝氨酸蛋白酶在微孢子虫感染的不同时间的表达变化趋势为进一步研究丝氨酸蛋白酶家族在家蚕微孢子虫与宿主家蚕互作中的作用奠定了基础。     

家蚕类p23蛋白基因的表达分析

p23蛋白发现于Hsp90分子伴侣复合体中,在真核生物中广泛存在且高度保守。家蚕中的同源蛋白命名为类p23蛋白。逆转录PCR显示类p23蛋白基因Bm-p23-like在家蚕5龄第6 d幼虫的卵巢、睾丸等8个组织中有表达,但拷贝数有较大差异,可能与组织的活跃程度有关。利用实时定量PCR技术对Bm-p23-like及hsp90在家蚕温度胁迫条件下的表达进行定量分析,结果显示：在高温条件下,该基因与hsp90表达较对照组均有增加,二者比值是42.23（非胁迫对照组是25.10）;在低温条件下,该基因的拷贝数是对照的19.90倍,而hsp90是对照的0.60倍,二者比值仅为0.89。因此,我们推测在温度胁迫条件下家蚕类p23蛋白具有独立于Hsp90的功能。     

家蚕新品种耐氟性研究

由于工矿企业的迅速发展,使大气污染日益严重,空气中的氟被桑叶吸收引起蚕中毒的现象时有发生。1982年春浙江杭嘉湖地区在2000km~2的范围内分散发生程度不同的家蚕中毒事件,造成的经济损失,仅茧款一项就达1000万元。江苏     

不同浓度漂白粉澄清液浸消桑叶对家蚕健康性及经济性状的影响

用０．２％、０．３％、０．４％和０．５％有效氯漂白粉澄清液全龄浸消桑叶、清水浸桑叶及未处理叶分别饲蚕,比较浸消桑叶对家蚕健康性及经济性状的影响。结果表明：①各种桑叶区、叶发育经过基本一致;②０．２％～０．５％有效氯漂白粉澄清液浸消区能显著降低蚕病的发生,对蚕的健康性无良影响;③浸消区对家蚕丝质无不育影响;④产卵成绩以清水浸叶区较好,有效氯０．５％的漂白粉澄清液浸叶对产卵成绩有一定影响。     

PCR技术在植物检疫性病害鉴定中的应用

简述了传统PCR、实时定量PCR以及多重PCR技术的基本原理及在植物检疫中的应用,分析了目前PCR技术存在的问题和应用前景。     

蚯蚓提取液对家蚕热激蛋白水平及免疫功能的影响

为探讨蚯蚓提取液对家蚕热激蛋白的表达及免疫功能的影响,家蚕5龄幼虫饲喂蚯蚓提取液(50、100和200倍原液稀释)处理的桑叶,饲喂6 d后解剖获取家蚕中肠及血淋巴组织,利用实时荧光定量PCR检测中肠组织中HSP70和HSP90基因的表达;利用ELISA试剂盒检测中肠和血淋巴中HSP70、HSP90、溶菌酶(lysozyme)和抗菌肽(attacin)的水平。结果表明:1/100和1/200稀释组家蚕中肠组织中HSP70基因表达分别是对照组的2.97和1.86倍(P<0.05),1/100稀释组家蚕中肠组织中HSP90基因表达是对照组的2.2倍(P<0.05);1/50稀释组中肠HSP70和血淋巴抗菌肽显著高于对照组(P<0.05);各处理组中肠和血淋巴中HSP90差异不显著(P>0.05)。由此可见,桑叶中添食蚯蚓提取液可促进热激蛋白的表达,提高抗菌肽的水平,进而提高蚕体的抗性和免疫功能。     

家蚕抗氟性双列杂交遗传分析

分别以氟敏指数和存活率为抗氟性指标，对家蚕的抗氟性进行了双列杂交遗传分析，结果表明，家蚕的抗氟性表现为部分显性遗传，主要由基因的加性效应控制，但也有显性效应和母体效应，不存在互作效应。显性位上基因分布是不对称的。抗氟性还受父本的影响，表现非母体的正反交差异。以存活经为指标的抗氟性遗传力估值为８６．０８％，以氟敏指数为指标的抗氟性遗传力估值为７８．４７％。     

RAPD分子标记技术应用于家蚕品种纯度检测的研究

对家蚕品种“932”、“75 32”、芙蓉、湘晖等的原种 ,“932”×芙蓉、“75 32”×湘晖的杂交原种 ,(“932”×芙蓉 )× (“75 32”×湘晖 )F1杂交种进行RAPD分子标记纯度检测筛选 ,经过 180个随机引物的筛选 ,获得可用于判别“932”×芙蓉、“75 32”×湘晖杂交原种、(“932”×芙蓉 )× (“75 32”×湘晖 )四元杂交种纯度的分子标记 ,初步建立了从DNA提取到纯度判别的技术方法。     

家蚕耐氟机理研究

[目的]研究家蚕的耐氟机理。[方法]以耐氟家蚕品种T6和氟敏感家蚕品种733新为供试品种,采用酸浸提法测定蚕沙、饲料、全蚕体的氟含量。[结果]添氟和不添氟饲料的实测含氟量分别为413.3和56.5mg/kg。在添氟14d后,耐氟组家蚕品种T6个体粗大仍然健康;氟敏感家蚕品种733新个体很小,取食量显著下降,蚕沙量比对照组明显减少,表现出明显的氟中毒症状。添氟初期和表现症状的后期,氟敏感家蚕的蚕沙氟含量有所波动。从第8天开始,耐氟家蚕品种的蚕沙氟含量显著下降。氟敏感品种733新的排泄能力高于耐氟品种T6。耐氟和氟敏感家蚕的蚕沙平均氟含量与全蚕体内氟含量的和相近。[结论]家蚕体内可能有某种（类）氟过氧化物酶,使游离氟失去毒害作用。     

蚕丝丝胶蛋白粉制取的研究

介绍利用煮茧水及缫丝厂的废液提取丝胶的方法,分析不同方法对丝胶的制取及水溶性的影响.结果表明,FeSO4和Ca(OH)2法提取的丝胶率最高,经盐溶液处理获得的丝胶蛋白粉末在室温下易溶于水.还探讨了丝胶在不同领域中的应用效果及其开发前景.     

家蚕hsp24.3基因的克隆及功能研究

 【目的】对家蚕 hsp24.3基因（Bmhsp24.3）的功能进行研究,为选育抗逆境家蚕品种提供基础材料和理论依据。【方法】在对家蚕基因组进行生物信息学分析的基础上,对家蚕低分子量热激蛋白基因 Bmhsp24.3进行克隆,然后利用家蚕的芯片数据对 Bmhsp24.3基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达模式进行分析,并利用半定量 RT-PCR技术,分别对 Bmhsp24.3基因在正常情况下和热刺激条件下家蚕5龄幼虫不同发育时期（1～6 d）后部丝腺中的表达状况以及10个不同家蚕品种5龄第3天幼虫丝腺中的表达情况进行了检测;最后将 Bmhsp24.3基因进行原核表达,获得重组蛋白 rBmHSP24.3,并进一步对该重组蛋白的功能进行了体外验证。【结果】Bmhsp24.3基因的编码区（CDS）长度为633 bp,编码210个氨基酸,为单外显子基因;RT-PCR检测发现该基因在家蚕的体壁、脂肪体以及丝腺组织中有较高水平表达,在其它组织中的表达不明显;同对照相比,不同家蚕品种以及不同发育时期的5龄幼虫在热刺激后,其后部丝腺中的Bmhsp24.3基因的表达显著升高。经 Native-PAGE和 SDS-PAGE分析表明,在高温条件下,表达获得的重组蛋白rBmHSP24.3能与硫氰酸酶形成稳定的复合物,使底物蛋白免受热刺激胁迫而变性,从而起着分子伴侣的作用。【结论】重组蛋白 rBmHSP24.3在体外具有分子伴侣的功能,推测该蛋白在家蚕体内同样具有分子伴侣的功能,在家蚕的抗逆境适应过程中起重要作用。     

家蚕TPR基因的克隆

[目的]克隆家蚕TPR基因,为研究该基因功能提供依据。[方法]利用Trizol法提取家蚕蛹期总RNA,再用RT-PCR方法对家蚕TPR基因进行克隆。[结果]成功得到家蚕TPR基因全cDNA序列,并用PCR扩增得到了TPR基因的ORF,全长858 bp。[结论]首次对家蚕TPR家族基因进行了克隆,为今后对该基因功能研究奠定了坚实的基础。     

家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析

[目的]从分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性,为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据.[方法]跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况,调查家蚕病原性微孢子虫的分布;通过测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率及检验带毒蚕种的微粒子病胚种传染率,调查家蚕病原性微孢子虫的感染性;基于微孢子虫SSU rRNA序列构建家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析,调查家蚕病原性微孢子虫的分类特征.[结果]不同时间和不同蚕区生产饲养的广西家蚕均存在一定量的微孢子虫感染,蚕种微粒子病发生率(毒率)呈波动起伏态势.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫对家蚕均具有较强食下传染力,大部分异型微孢子虫对家蚕的IC50与N.b同一级别;各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力存在明显差异,N.b的胚种传染率达51.67%,其他异型微孢子虫均比N.b低,部分异型微孢子虫(GXM6和GXM13)对家蚕无胚种传染力.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上,除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5间存在较低分化度和较高相似度外,其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异.[结论]广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛,种类繁多,且各种微孢子虫的感染力存在明显差异,即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性.     

家蚕ga Pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇（Drosophila melanogaster）甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（AAN09371）氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列．家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶（bmga pdh）基因长1485 bp（NO：DQ202316）,包括5′UTR 221 bp,3′UTR 265 bp和完整的999 bp ORF框,编码333个氨基酸残基．用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91％,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71％．bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包含3个外显子．3′UTR序列包含AATAA终止信号和Poly（A）．推导的氨基酸序列N端包含与NAD^＋结合的保守结构域：ASCTTNCL．     

家蚕脱胶蚕丝的蛋白组成成分

【目的】探讨家蚕（Bombyx mori）蚕丝纤维脱胶后蛋白质成分的变化,为了解丝蛋白在蚕丝纤维中的分布特征打下基础,并为改进蚕丝纤维加工工艺提供依据。【方法】利用木瓜蛋白酶、碳酸钠、尿素、中性皂和碱水法5种方法对蚕茧进行脱胶处理;并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同方法处理的蚕丝和不同蚕丝加工产品的脱胶程度,以及脱胶对丝素的影响;利用FASP酶解法和液相色谱-串联质谱联用的技术鉴定不同方法脱胶后的蚕丝及各种蚕丝加工产品的蛋白组分;利用生物信息学的方法对鉴定到的丝蛋白进行注释并通过非标定量的方法比较各种样品中丝蛋白的丰度。【结果】通过5种方法对蚕茧丝进行脱胶,蛋白电泳检测发现木瓜蛋白酶法降解丝胶蛋白的同时基本不会破坏丝素蛋白;碳酸钠法对丝胶的降解能力较弱,但对丝素的降解较强;中性皂法和尿素法对丝胶蛋白和丝素蛋白的降解都比较严重;碱水法的效果不理想。通过蛋白质组学研究发现木瓜蛋白酶和中性皂法脱胶后的蚕丝中几乎没有丝胶蛋白,主要是丝素蛋白、seroin 1和甘氨酸富含蛋白等;尿素法和碳酸钠法脱胶后的蚕丝中残留蛋白最少,主要是丝素蛋白和甘氨酸富含蛋白等。通过蛋白电泳检测了6种蚕丝加工产品中的蛋白质,发现生丝和胚绸中的丝素蛋白比较完整,绸、缎和电力纺中的丝素蛋白出现了部分程度的降解,而丝绸旧衣中的丝素蛋白有严重的降解。通过蛋白质组学分析发现生丝和胚绸中的主要成分包括3种丝素、丝胶1、seroin 1、osiris 9a、甘氨酸富含蛋白和蛋白酶抑制剂SPI51等;绸、缎和电力纺的主要成分包括3种丝素蛋白和seroin 1,而丝绸旧衣中的主要成分包括3种丝素蛋白和甘氨酸富含蛋白。【结论】木瓜蛋白酶脱胶法能够最大程度地保持丝素纤维的完整性,碳酸钠和尿素法的脱胶程度最高。生丝和胚绸中的丝胶蛋白含量很高,丝素纤维比较完整。绸、缎和电力纺中的丝胶蛋白很少,丝素纤维有部分程度的降解。蚕丝经过彻底的脱胶后还剩余的蛋白包括丝素重链、丝素轻链、丝素p25、seroin 1和甘氨酸富含蛋白。     

家蚕脓病的防治技术

介绍了家蚕脓病的分类及症状,并且指出了防治方法.     

家蚕TPR基因的克隆

[目的]克隆家蚕TPR基因,为研究该基因功能提供依据。[方法]利用Trizol法提取家蚕蛹期总RNA,再用RT-PCR的方法对家蚕TPR基因进行克隆。[结果]成功得到家蚕TPR基因全cDNA序列,并用PCR扩增得到了TPR基因的ORF,全长858bp。[结论]首次对家蚕TPR家族基因进行了克隆,为今后对该基因功能研究奠定了坚实的基础。     

家蚕ga Pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇(Drosophila melanogaster)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(AAN09371)氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列.家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶(bmgapdh)基因长1 485 bp(N0:DQ202316),包括5'UTR 221 bp,3'UTR 265 bp和完整的999 bpORF框,编码333个氨基酸残基.用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91%,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71%.bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包舍3个外显子.3'UTR序列包含AATAA终止信号和Poly(A).推导的氨基酸序列N端包含与NAD+结合的保守结构域:ASCTTNCL.