烟草花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的构建

[目的]防止隐症携带烟草花叶病毒(TMV)的烟苗移栽到大田造成产量损失。[方法]根据TMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守序列设计引物及探针,通过绘制标准曲线、重复性、特异性及灵敏性分析,建立了一种TMV的TaqMan-qPCR检测方法。[结果]该方法特异性好,与其他常见的烟草病毒无交叉反应;灵敏度高,检测下限可达到4.53×10¹ copies/μL,比常规RT-PCR检测灵敏度提高了10倍;建立的标准曲线斜率为-3.299,决定系数(R²)为0.993 3,扩增效率为100.97%,且循环阈值(Ct)与质粒标准品浓度之间线性关系良好,重复性试验结果可靠。[结论]利用建立的TaqMan-qPCR检测方法与常规RT-PCR检测方法同时检测烟苗样品,检测结果一致,进一步验证了荧光定量PCR方法的可靠性。     

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。     

猪链球菌9型荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。【结论】成功建立的SS9 FQ-PCR诊断方法,可用于临床SS9型病菌感染的快速诊断及样品中细菌含量的定量分析。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N基因保守序列设计引物与TaqMan探针,在建立常规PCR的基础上,设计并优化了TaqMan荧光定量PCR方法用于PRRSV核酸的检测.应用新建立的荧光定量PCR方法检测其它主要猪病病原,无任何非特异性反应;针对PRRSV阳性克隆质粒的检测灵敏度可以达到1.2×101 copy/ml,比常规PCR高100倍;通过对48份临床疑似样本的检测表明有29份样本为PRRSV阳性,与巢式PCR检测结果一致,而常规PCR只能检出其中19份阳性样本,灵敏度优于常规PCR方法.结果表明,试验建立的PRRSV TaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可为PRRSV临床诊断提供一个更为有效的方法.     

五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为五倍子蜂蜜的鉴定检测提供技术支撑,利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,以五倍子树基因组中ITS基因为靶序列,设计并筛选出特异性引物探针,通过特异性、灵敏度和重复性等试验,建立五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。结果表明:建立的方法特异性良好,生成的标准曲线有良好的线性关系,相关系数(R2)为0.998,最低检测限为0.2pg DNA/反应。该方法特异性强、灵敏度高、结果可靠。     

香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉细菌性枯萎病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计并合成一对引物和一条具有稳定点突变特异性探针，建立了对香蕉细菌性枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。除烟草青枯病菌和马铃薯青枯病菌外，还对其它属细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明，只有香蕉细菌性枯萎病菌产生荧光，其它细菌都没有荧光产生。从而证明此方法特异性强，灵敏度高，适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。     

猴痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank发表的猴痘病毒(AF380138)F3L基因全序列,设计并合成了引物和TaqMan、MGB探针,建立了F3L基因的荧光定量PCR检测方法.应用该方法可从人工合成的猴痘病毒F3L基因片段(48048～48 509 bp)扩增典型的"S"型曲线,25 μL反应体系检测灵敏度可达68拷贝,但不能从鸡痘、山羊痘等病毒中扩增出相应的扩增曲线.结论:本方法可快速、敏感、特异地检测猴痘病毒.     

TaqMan探针实时荧光定量PCR诊断犬瘟热病毒方法的建立

根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示:实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。     

猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

应用RT—PCR检测辣椒上的黄瓜花叶病毒

根据黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,运用两步法RT—PCR与一步法RT—PCR都可以从感病组织中扩增出与预期的780bp大小一致的目标片段。两种方法相比,一步法的特异性强、灵敏度高、省时经济、程序简单,达到了快速检测的目的。应用一步法RT—PCR对采集于山东辣椒产区的病毒病样本进行检测,结果表明6个采样地点的样本中均检测到CMV,在所采集的30个病毒病样本中CMV所占的比例为33．3％,说明CMV是山东省辣椒病毒病主要毒源之一。     

低温胁迫对黄瓜花叶病毒CMV-BG株系cp基因多态性的影响

研究了低温胁迫下黄瓜花叶病毒与三生烟互作后CMV cp基因序列的变化规律,并分析了植物RNA病毒的进化机制。用黄瓜花叶病毒北京甘蓝分离物(CMV-BG)侵染三生烟不同单株,置于不同温度条件下(常温和低温)培养30 d后,对CMV cp基因进行克隆、序列测定和多态性分析。结果表明,侵染低温组植物CMV的cp基因多态性(Pi=0.001 76)高于常温组(Pi=0.001 14),IFEL分析检测到低温组第48个氨基酸位点为正选择位点,初步表明低温胁迫有助于提高CMV-BG cp基因序列的多态性,温度胁迫是植物RNA病毒与宿主互作过程中基因序列变异的一种重要的作用力。     

来自安徽不同地区黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）cp 基因的分子进化分析

为了揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)安徽分离物分子变异及系统进化情况,从安徽省5个地区采集感染CGMMV的葫芦科样本。提取感病样本总RNA,经RT-PCR扩增、克隆和测序,获得17个CGMMV分离物的cp基因序列。序列比对发现,17个CGMMV安徽分离物的cp基因核苷酸序列相似性极高,达98.4%~100%,与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物cp基因核苷酸序列相似性也非常高,达98.6%~100%,而与CGMMV西班牙分离物和俄罗斯分离物cp基因核苷酸序列相似性相对较低,为90.7%~92.6%。从构建的系统关系树可以看出,17个CGMMV安徽分离物与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物形成1个单独的分支,而CGMMV俄罗斯与西班牙分离物聚成另1个分支,说明来源于中国和东亚的CGMMV亲缘关系较近。     

抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化

【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转基因植株。【结果】成功构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,并用其转化番茄植株,从转化的1 500个愈伤组织中获得33株再生植株,利用PCR对再生植株进行检测,显示从33株再生植株中获得了19株转基因植株,转化率为1.26%。【结论】构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,用其转化红番3号加工番茄,获得了转基因植株。     

花绒寄甲荧光定量PCR分析中内参基因的选择

合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件。以存活时间为6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的花绒寄甲成虫为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了核糖体蛋白11(RPS),丁二酸脱氢酶复合物(SDHA)、组蛋白(Histone)、泛素结合蛋白(UBC)、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅰ(PGK)、延伸因子(EF-1α)、β-肌动蛋白(β-Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白RPL13(L13)、α-微管蛋白(α-Tubulin)共10个看家基因mRNA的表达情况。经过geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个统计学程序,综合分析确定RPS基因或α-Tubulin基因在不同存活时间的花绒寄甲中为较佳用于校正目标基因的内参选择,而RPS、GAPDH和α-Tubulin的组合为最佳校正目标基因内参基因组合。     

木尔坦棉花曲叶病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法

【目的】木尔坦棉花曲叶病毒Cotton Leaf Curl Multan Virus（CLCuMV）是为害锦葵科植物的重要双生病毒之一,本研究的目的是建立CLCuMV定量检测方法,为进一步研究其在寄主植物内的增殖动态、在介体昆虫内循环和其与寄主、介体间互作机制提供技术手段.【方法】 以纯化的含CLCuMV基因组的质粒为模板,利用 SYBR Green I 荧光定量 PCR对不同浓度的质粒样品进行CLCuMV扩增,制作标准曲线.依照建立的标准曲线,计算烟粉虱Bemisia tabaci及朱槿Hibiscus rosa-sinensis中CLCuMV的含量.【结果和结论】 该定量检测法可检测到低浓度（5.2×10¹ μL^-1)的CLCuMV,其灵敏度是常规PCR的10倍,可被用于在寄主植物和介体昆虫体内CLCuMV的定量检测.     

半巢式RT-Realtime PCR方法检测藜草花叶病毒

[目的]根据藜草花叶病毒(SoMV)全基因组中多聚蛋白质基因序列保守区,分别设计2套TaqMAN探针和引物,建立半巢式实时荧光PCR检测SoMV的新方法。[方法]提取病毒核酸进行反转录操作合成cDNA,依据设计好的2套TaqMAN探针和引物,分别进行实时荧光PCR特异性与灵敏度检测,并进行2套引物探针的扩增效率对比试验。[结果]方法特异性强,灵敏度高达0.4 fg/μL植物总RNA,2套引物探针的扩增效率试验对比结果显示扩增效率几乎完全一样。[结论]该方法适用于藜草花叶病毒的检疫鉴定。     

一株侵染掌叶半夏的大豆花叶病毒的全基因组序列测定和vsiRNA特征分析

【目的】探究侵染掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）的大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）衍生的干扰小RNA（virus-derived small interfering RNA,vsiRNA）序列特征,为掌叶半夏抵御病毒的作用机制研究提供参考。【方法】以一株来自广西的具有典型病毒病症状的掌叶半夏为材料,取其褪绿斑驳的叶片采用TRIzol法提取总RNA,并进行小RNA深度测序（Small RNA Deep Sequencing）;利用快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE）和分段克隆技术获得病毒的全长基因组序列,利用MEGA 7.0将其与有代表性的病毒序列构建系统发育进化树并分析亲缘关系;以克隆测序获得的基因组序列作为参考进行vsiRNA特征分析。【结果】小RNA深度测序共获得4851249条高质量的读段（reads）,长度为21、22和24 nt的reads具有较高的丰度,占比分别为33.4%、13.7%和11.3%。该病毒分离物的基因组全长为9735 nt,编码3105个氨基酸,其基因组全序列与SMV HZ1分离物核苷酸序列相似性为86.93%,暂命名为SMV NN;系统发育进化树显示,SMV NN与分离自半夏的SMV HZ1分离物的亲缘关系最近。将vsiRNA定位到克隆测序后获得的SMV NN的基因组上,分析该病毒的vsiRNA特征,结果发现长度为21和22 nt的vsiRNA具有较高的丰度,病毒全基因组的正链和负链均能被vsiRNA覆盖,且分别在HC-Pro和P3蛋白编码区具有最强热点。【结论】掌叶半夏主要通过dicer样核糖核酸酶4（dicer-like ribonuclease 4,DCL4）和Argonaute蛋白1（Argonaute1,AGO1）对SMV的HC-Pro和P3蛋白编码区进行剪切,主要产生长度为21和22 nt的vsiRNA,从而抑制SMV在植株体内的复制。     

鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立

为建立基于鸭源宿主细胞的蛋白激酶PKC基因的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank数据库的PKC基因设计、合成特异性引物,通过PCR技术扩增目的基因片段,构建重组质粒GV pXT19-TPKC,并以其为阳性标准品建立荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行重复性、特异性和敏感性验证。结果显示,荧光定量PCR标准曲线为y=-3.334 0x+44.199,相关系数为0.995 4,扩增效率为99.19%;熔解曲线仅出现单特异峰,未检测到H5亚型/H7亚型/H9亚型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鸭肝炎病毒等参考毒株的核酸样本的荧光信号。说明,建立的荧光定量PCR方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。     

荧光定量PCR技术检测红壤稻田土壤厌氧氨氧化细菌

利用厌氧氨氧化细菌16S rDNA基因特异引物对红壤稻田土壤总DNA进行扩增、PCR产物纯化、克隆和测序,得到属浮霉菌(Planctomycetes)的厌氧氨氧化细菌的部分16S rDNA序列(长度为502 bp)。以含该序列的重组质粒作为荧光定量PCR的标准品,对水稻不同生育期红壤稻田土壤中的厌氧氨氧化细菌数量进行检测。结果表明水稻各生育期内稻田表层和根层土壤中均存在一定数量的厌氧氨氧化细菌,且其数量随水稻生长有所变化。表土中的数量随水稻生长呈逐渐增加的趋势,根层土的数量在水稻生长前期变化不大,孕穗期后明显增加。红壤稻田土壤中存在的厌氧氨氧化细菌对稻田土壤的硝化作用可能具有一定贡献。     

感染甘蔗花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库的构建及评价

为了研究甘蔗(Saccharum officinarum L.)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的互作机制,构建感染SCMV的甘蔗叶片的酵母双杂交cDNA文库。以热带种Badila为供试材料,提取感染SCMV植株的叶片总RNA,分离纯化获得mRNA,通过反转录反应合成3种读码框的双链cDNA。用Gateway技术,通过BP和LR反应,将cDNA迅速重组到酵母双杂交载体pGADT7-DEST上,构建酵母双杂交文库。结果表明,文库容量为2.0×107cfu,随机挑取24个克隆检测,重组率为100%,cDNA插入片段长度主要分布在1kb~2kb,文库质量较好。说明该文库的构建为筛选与SCMV互作的甘蔗寄主因子基因,研究甘蔗与SCMV的互作机制及甘蔗抗花叶病育种奠定基础。