猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用RT-PCR扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因并克隆至原核表达载体pET-28a,转化到宿主表达菌BL21后经IPTG诱导表达和Ni柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组N蛋白,其大小约为58 ku。将纯化重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合,PEDV间接ELISA方法筛选,制备获得4株能稳定分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和间接免疫荧光试验证明其与PEDV均有特异性反应,单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型。杂交瘤细胞培养上清ELISA抗体效价为1∶1 600~6 400,腹水ELISA抗体效价达1∶1.024×105以上;4株细胞连续培养20代,其ELISA抗体效价基本一致。本研究为PEDV感染的诊断和致病机制研究提供了有用工具。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光.     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3～5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5～1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

本研究以猪流行性腹泻病毒(PEDV)全基因组为模板,利用RT-PCR方法扩增PEDV S基因的亲水区,将其克隆至pMAl-c2E原核表达载体,获得重组质粒pMAl-c2E-PEDV-S。经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切测序鉴定后,转化BL21菌,经IPTG诱导,成功表达了约74 kDa的重组蛋白MBP-PEDV-S,亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白免疫3只健康的6～8周龄雌性BALB/c小鼠,将小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得了4株能稳定分泌抗PEDV S蛋白抗体的杂交瘤细胞株1B11、1B10、1C8、3L3,其腹水效价都高于1∶100 000。获得的4株单克隆抗体与PEDV经IFA和Western blot检测,结果显示均具有良好的反应性。而且3株单克隆抗体重链为IgG2a,1株重链为IgG2b;3株轻链为Kappa,1株轻链为Lambda。本研究表达了PEDV S蛋白并制备了单克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）,通过蔗糖密度梯度离心将其纯化,获得较为完整的病毒颗粒。病毒ＥＬＩＳＡ效价为１∶３×１０５,蛋白含量为３．９６ｇ／Ｌ。将提纯的ＰＥＤＶ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取免疫鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合,融合率为９５．６％。用间接ＥＬＩＳＡ进行筛选,共检出３８个阳性孔,阳性率为２８．８％。对其中１５个阳性值较高的孔进行３次再克隆,阳性率达１００％,最后获得１５株稳定分泌特异性抗ＰＥＤＶ单抗（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。ＥＬＩＳＡ阻断试验与交叉试验证明,其分泌的抗体具有高度特异性。腹水和细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ效价分别为１∶１０３～１∶１０６和１∶１２８～１∶５１２。经鉴定,１５株ＭｃＡｂ的分子类型均为ＩｇＧ,均无免疫沉淀特性。杂交瘤细胞的染色体数目为９０～１１０,平均９５。尤为重要的是,这些杂交瘤细胞所分泌的抗体,有的对ＰＥＤＶ具有中和作用,能够阻断病毒对猪只的侵害作用。     

1株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白的抗原表位,本研究通过原核表达N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合和亚克隆技术,筛选出1株稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞9B4。经鉴定单克隆抗体9B4的亚型为IgG1型,轻链为Kappa链。腹水抗体ELISA效价为10~6以上。ELISA、Western blot和免疫荧光鉴定结果显示该单克隆抗体反应原性和特异性良好。利用噬菌体展示技术对单克隆抗体9B4进行抗原表位鉴定,获得4个N蛋白的模拟抗原表位(C11、C12、C14和C26)。随后分别以噬菌体阳性克隆为模拟抗原,对临床PEDV血清样品进行检测,发现其均能与猪PEDV阳性血清发生特异性结合,而与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)阳性血清不反应,说明本研究获得的N蛋白模拟表位可用于PEDV抗体的检测,有助于PED流行病学调查和PEDV疫苗免疫效果的评价。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析

以猪流行性腹泻病毒（PEDV）可溶性的猪氨基肽酶N受体为靶蛋白对PEDV S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于PEDV S蛋白的第249-529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV多克隆抗体反应。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的重组PEDVN蛋白为抗原免疫7周龄雌性BALB／c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了7株稳定分泌抗重组N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为9C1、7H8、3C10、6C4、10G9、2C10和483。7株杂交瘤细胞诱导小鼠产生的腹水抗体效价分别为1：3200、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：6400和1：12800。9C1、7H8、3C10、6C4、10G9和2C10免疫球蛋白类型均为IgM,轻链均为K链;483免疫球蛋白类型为IgG2a,轻链为K链。Westernblot试验结果显示,这7株单克隆抗体均能与天然的PEDVN蛋白发生反应。     

表达猪流行性腹泻病毒纤突蛋白的重组水泡性口炎病毒构建和鉴定

为表达猪流行性腹泻病病毒(porcine epidemic diarrhea,PEDV)纤突蛋白,利用Mega7基于PEDV纤突蛋白氨基酸序列进行遗传进化分析,选择新发流行毒株纤突蛋白基因,以重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体,在rVSV_MT基因组G和L间插入目的基因,通过反向遗传学技术拯救VSV_MT-S△19重组病毒,Western blot和RT-PCR鉴定重组病毒是否成功表达PEDV纤突蛋白,采用一步生长曲线鉴定VSV_MT-S△19在Vero细胞中的生长特性,并与弗氏佐剂混合后肌肉注射小鼠探究其在动物体内的免疫效果。遗传进化分析发现,插入rVSV_MT的纤突蛋白基因序列PEDV/CHN/SH-2012-5属于PEDV新发流行毒株GⅡ型; RT-PCR分析重组病毒表达纤突蛋白基因无突变; Western blot鉴定显示出PEDV纤突蛋白和VSV病毒特征条带;一步生长曲线表明重组病毒VSV_MT-S△19体外复制滴度可达108TCID50/m L,与VSV_MT-GFP无显著性差异(P> 0. 05);小鼠动物试验结果表明,重组病毒成功激发PEDV中和抗体产生,与对照PBS接种组差异显著(P<0. 05)。研究表明,利用重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体表达GⅡ型PEDV纤突蛋白能有效激发机体产生高水平中和抗体,为PEDV亚单位疫苗的研制提供了理论和实践依据。     

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白中和活性单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备具有中和活性的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究利用PRRSVSD53株的超离病毒作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠并进行细胞融合。采用PRRSVSD53株和真核表达的PRRSV各结构蛋白作为检测抗原,应用间接免疫荧光试验(IFA)筛选到一株稳定分泌抗SD53株GP4蛋白的杂交瘤细胞株(LM26)。抗体亚类鉴定其为IgG2a,轻链为κ链。原核表达一系列截短的GP4蛋白鉴定LM26的抗原表位结果显示,LM26识别的抗原表位序列为57VVLQDI^62,此抗原表位在美洲型PRRSV中相对保守。病毒中和试验结果显示,MAb LM26仅针对PRRSV SD53株具有中和活性,中和效价最高为1∶50,对其它美洲株PRRSV均不具有中和活性。该MAb的制备为进一步研究PRRSVGP4蛋白的结构和功能奠定了基础。     

携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原(HBcAg)为载体呈现猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1抗原表位的病毒样颗粒.将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域(MIR),构建重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SD...     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位的筛选及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的 应用生物学软件与单克隆抗体技术相结合的方法鉴定PEDV S2基因B细胞表位肽。方法 利用CLC Sequence viewer 6.8软件及在线数据库IEDB筛选出PEDV S2基因B细胞表位,并人工合成表位肽。将表位肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）耦联后作为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,通过ELISA法筛选出抗体效价较高的小鼠进行1次加强免疫,3 d后取脾脏制备脾细胞悬液进行细胞融合。经HAT选择培养基培养筛选有效杂交瘤细胞,采用ELISA法筛选阳性克隆继续进行扩大培养。将部分阳性杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射,并收集腹水。通过ELISA方法分别检测小鼠腹水和单克隆细胞株培养上清液抗体效价,确定最高效价作为后备细胞株。结果 筛选出B细胞表位肽序列为:MQYVYTPTYYML;免疫多肽抗原后融合前血清抗体效价达到1:2 000;BALB/c小鼠腹水及单克隆细胞株培养物上清液ELISA检测结果显示抗体效价达到1:4 000。结论 筛选出了PEDV S2基因B细胞表位,为PEDV表位肽疫苗载体构建研究提供参考。     

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。     

尼帕病毒和亨得拉病毒核蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

尼帕病毒（Nipahvirus，NiV）和亨得拉病毒（Hendravirus，HeV）是近年来出现的2种新的高致病性副粘病毒，在我国尚未发现。为防范2种病毒在我国的出现，本研究开展了前瞻性工作，成功研制了针对2种病毒核蛋白（N）的单克隆抗体，可用于病毒监测与诊断。首先利用大肠杆菌表达的2种病毒N蛋白免疫BALB／c小鼠，细胞融合后应用间接免疫荧光的方法对杂交瘤细胞克隆进行筛选，获得了5株N蛋白特异单抗。单抗腹水的抗体效价均超过2×10^5，培养上清抗体效价1：64～1：256。Western—blot和间接免疫荧光试验证明，5株单抗均特异针对N蛋白，其中1株（H4D11）只与HeVN蛋白反应，而不与NiVN蛋白反应，表明它具有鉴别2种病毒的能力。所研制的单抗对建立2种病毒的检测技术，用于动物监测，以防范2种新发传染病在我国流行具有重要意义。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备及其对应表位区分析

为鉴定口蹄疫病毒(FMDV)的非结构蛋白3AB的抗原表位,本研究以原核表达并纯化的FMDV 3AB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,获得6株能够稳定分泌抗3AB蛋白特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞.这6株MAbs亚类鉴定均为IgG1型,轻链均为K链.间接免疫荧光试验结果表明,这6株MAbs均能够识别FMDV 3AB蛋白.采用制备的MAb对分段表达的3AB蛋白进行western blot分析,结合位点分别位于3AB的第aa 55～aa 70、aa 64～aa 79、aa130～aa145区段.该结果为进一步探索3AB蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.