生姜腐皮镰刀菌的分离鉴定及PCR快速检测方法构建

 由腐皮镰刀菌(Fusarium solani)引起的生姜枯萎病是一种毁灭性真菌土传病害,其病原菌的快速高效检测,有助于枯萎病的早期诊断及预警。通过回接试验、形态学观测以及系统进化树分析,对湖北生姜产区分离的菌株进行鉴定,获得生姜腐皮镰刀菌(F. solani)。基于镰刀菌属通用引物TEF-1αF/TEF-1αR基因序列,以腐皮镰刀菌基因组DNA为模板进行扩增测序,根据序列信息设计筛选出一对腐皮镰刀菌特异性引物,构建了基于普通PCR的快速高效分子检测方法,并对接种过病菌的生姜植株和土壤进行检测验证。通过病原菌的菌落形态、孢子显微结构观察、真菌通用引物ITS1/ITS4鉴定和致病性测定,确定引起生姜枯萎病的病原菌为腐皮镰刀菌(F. solani)。用设计的特异性引物F8/R8进行PCR,特异扩增获得约381 bp的目标条带,检测灵敏度为454 pg·μL^-1,利用该引物对带菌生姜幼苗和土壤进行检测验证,证实可从发病生姜幼苗和带菌土壤中特异性检测到腐皮镰刀菌(F. solani)。本研究明确了引起湖北生姜枯萎病的病原菌为腐皮镰刀菌(F. solani),并建立了PCR快速检测方法。该检测方法简便、灵敏、高效,可用于生姜枯萎病的早期诊断与预防。     

大豆猝死综合症病菌检测技术研究

 大豆猝死综合症是美国等几个大豆主产国的一种较新的、危害性很大的大豆真菌病害,它分别由两种镰刀菌Fusarium virguliforme和Fusanum tucumaniae引致。本研究确立了从土壤中筛选、分离大豆猝死综合症病菌的选择性培养基PCNB;明确了中国具有对该病菌敏感的大豆品种;利用Southern杂交技术,将致病菌和近似菌的基因组DNA分别用EcoRI酶切,与mtDNA探2u18和4u40杂交的RFLP图谱可成功的鉴定F.virguliforme,F.tucumaniae和近似菌F.phaseoli。由此建立了,通过选择性培养基分离进口大豆中的土壤,进而以Southern杂交技术鉴定大豆猝死综合症病菌的检测方法。     

利用RAPD-STS和实时定量PCR鉴别菠菜枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.spinaciae)

 菠菜枯萎病是由致病性镰刀菌(F.o.f.sp.spinaciae)引起的,是菠菜生产中的重要病害之一。利用常规方法鉴定菠菜枯萎病病原菌需耗费大量时间,并且很难得到正确的结论。随机扩增多态性DNA序列标签(Randomly amplified polymorphic DNA-sequence tagged sites,RAPD-STS)为病原菌鉴定提供了一种有效方法。本研究通过对供试菌株的RAPD分析,克隆出了1个菠菜枯萎病病原菌的特异片段(GenBank登录号:AY337463)。根据测序结果设计了1对菠菜枯萎病病原菌的特异引物,并利用常规PCR和实时定量PCR(real-time PCR)2种方法对病原菌进行了鉴定,并对2种方法的敏感性进行了比较。结果表明,2种PCR方法都可以鉴定菠菜枯萎病病原菌(F.o.f.sp.spinaciae),但二者对病原菌DNA敏感程度不同,常规PCR检测的最低DNA量100Pg,而实时定量PCR检测的最低DNA量是1pg。同时,实时定量PCR还可以对病原菌DNA进行定量分析,并依此估算病原菌的数量。该方法可用于菠菜枯萎病病原菌的快速鉴定和病因诊断。     

抗苯并咪唑的小麦赤霉病菌β-tubulin基因序列分析与特性研究

 本研究用真菌U-微管蛋白基因的通用寡聚核苷酸引物B1和B3,扩增并克隆了一段821 bp的小麦赤霉病菌Fusarium graminearum的U-微管蛋白基因片段,并进行了序列测定。根据该序列设计了F.graminearum U-微管蛋白基因的特异性测序引物,测定了赤霉病菌对多菌灵不同抗感菌株的U-微管蛋白基因核苷酸序列,结果表明不同F.graminearum菌株的U-微管蛋白的165,198,200和257位氨基酸未发生突变,在克隆的片段内也未发现核苷酸突变引起的氨基酸改变。表明该菌对多菌灵产生抗性的分子机制与目前已知的其它真菌有所不同,有待进一步研究。     

甘薯根腐病病原的研究

 近年来,在我国河南、山东、江苏、安徽、河北、湖北省发生的甘薯根腐病,经分离鉴定,主要致病菌为爪哇镰孢(Fusarium javanicum Koord),爪哇镰孢根生变种(F.javanicum var.radicicola),茄病镰孢蓝色变种(F.solani var.coeruleum),其中以爪哇镰孢致病力最强,出现频率也高。另外,在病根中还常分离到串珠镰孢胶孢变种(F.moniliforme var.subglutinans),串珠镰孢(F.moniliforme Sheldon),尖孢镰孢(F.oxysporium Schlecht),菜豆壳球孢(Macrophomina phaseoli(Maubl.) Ashby),它们在单独回接时致病力弱或不致病。
在河南省分离得到了Fusarium javanicum Koord的典型菌株,在实验室条件下能经常产生子囊阶段甘薯隐赤壳(Hypomyces ipomoeae(Hals) Wr.],证明这个种在中国是存在的。     

十字花科蔬菜黑斑病菌的PCR鉴定

 在对十字花科蔬菜黑斑病菌(Alternaria sp.)3个种及相近种的5.8SrDNA和其侧翼ITS区进行测序的基础上,分别设计合成了鉴定白菜黑斑病菌3个种的特异性引物。PCR扩增结果表明:Abre1和Abre2引物对能特异性扩增芸苔链格孢(A.brassicae)371bp的片段,Abra1和Abra2引物对能特异性扩增甘蓝链格孢(A.brassicicola)457bp的片段,Ajap1和Ajap2引物对能特异性扩增萝卜链格孢(A.japonica)411bp的片段,而且其它近源种未扩增出目标片段,说明这3个引物对可以作为十字花科蔬菜黑斑病菌3个种快速检测鉴定的分子特征标记。     

河北廊坊大豆枯萎病病原镰刀菌的分子鉴定

 为明确河北廊坊中国农科院植保所试验基地大豆孢囊线虫病田内大豆枯萎病病原镰刀菌的种类,对362份罹病枯萎大豆植株进行病原真菌分离,得到335株真菌;使用镰刀菌通用引物鉴定出镰刀菌(Fusarium spp.) 279株,占分离菌株83.3%;镰刀菌特异性引物、测序等分子生物学技术结合形态学特征进一步鉴定镰刀菌种类,鉴定出尖孢镰刀菌(F. oxysporum)189株,占分离菌株56.4%;茄病镰刀菌(F. solani)67株占20.0%、禾谷镰刀菌(F. graminearum)16株占4.8%、木贼镰刀菌(F. equiseti)3株、层出镰刀菌(F. proliferaum)2株、燕麦镰刀菌(F. avenaceum)和厚孢镰刀菌(F. chlamydosporum)各1株;致病性测试结果表明数量最多的尖孢镰刀菌(F. oxysporum)中约92.8%菌株具有不同程度的致病力;这些结果表明该试验基地大豆枯萎病的优势病原菌为尖孢镰刀菌(F. oxysporum);研究结果可为大豆枯萎病的防治提供科学依据,并为大豆孢囊线虫与尖孢镰刀菌复合侵染大豆的研究奠定基础。     

西瓜蔓枯病分子诊断技术研究

 本文测定西瓜上的西瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)及西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)的rDNA的ITS序列,比对近缘种及西瓜上不同病菌的ITS序列同源性,设计出特异性上游引物XM-2和下游引物XM-R2。经过对XM-2/XM-R2引物的PCR扩增条件的优化,可以扩增出一条344bp的西瓜蔓枯病菌特异性DNA条带。上述方法可以检测到pg以上的蔓枯病菌基因组DNA,并且可以准确扩增出西瓜蔓枯病自然病样中特异性的DNA片段。本文建立了一项西瓜蔓枯病分子检测技术,该方法准确、快速、可靠,可用于西瓜蔓枯病田间的快速诊断。     

河南省玉米茎基部镰刀菌的形态和分子鉴定

 为明确河南省玉米茎基部镰刀菌(Fusarium spp.)的种群组成及分布, 2011和2012年, 我们采集了河南省14个地市42个县(区)的玉米茎基腐病病样, 分离得到163个镰刀菌单孢菌株。首先对菌株进行了形态学鉴定, 在此基础上使用镰刀菌种特异性引物进行了PCR检测;对于部分PCR检测未能确认的菌株进行了Translation elongation factor 1-α(TEF-1α)基因片段测序及BLAST分析, 最终将163个菌株鉴定到种。结果表明在163个菌株中, 禾谷镰刀菌F. graminearum为优势种, 占44.2%(72株), 其次为层出镰刀菌F. proliferatum和轮枝镰刀菌F. verticillioides, 分别占28.8%(47株)和27.0%(44株)。豫西北的焦作(47.6%)、洛阳(50.0%)及豫中的许昌(45.5%)均以F. verticillioides为主, 豫东的商丘(42.9%)、开封(57.1%)以F. proliferatum为主, 豫北的安阳(66.7%)、濮阳(71.4%)、新乡(62.5%)和豫南的南阳(57.1%)、驻马店(45.0%)以及中部的郑州(57.1%)、漯河(66.7%)则均以F. graminearum为优势种。     

烟草根黑腐病菌的PCR分子检测

 根据烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)与其它烟草病原真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spa-cer,ITS)序列间的差异,设计了一对特异性引物TB-5/TB-3,用于T. basicola的分子检测。利用该对引物对包括T. basicola在内的13个烟草病原菌菌株的基因组DNA进行PCR扩增,结果表明:只有T. basicola能扩增到一条400bp左右的特异性条带,其它菌株及阴性对照均无扩增产物。对烟草组织和土壤的检测结果也表明,该对引物能特异性的检测到T. basicola基因组DNA的存在。该引物对T. basicola基因组DNA检测的灵敏度为100fg/μL。     

百合鳞茎斑点病病原菌鉴定

 1991年在浙江湖州市和杭州市采集得百合(Lilium brownii F. E. Brown var. viridulum Baker)鳞茎有褐色斑点的标本104份,分离出纯菌株108个。鉴定为2个镰刀菌种:Fusarium solani(Mart.)Sacc. 和F. oxysporum Schlecht. F. solani出现频率84.3%,占优势.田间调查和接种试验证明F.solani是百合鳞茎褐色斑点病主要致病菌。在20种植物上接种试验结果表明:F.solani对百合有专化性,因此鉴定其病原菌为茄病镰孢一个新专化型:Fusarium solajni f. sp.lilii Wang.     

马铃薯晚疫病菌对甲霜灵抗性的快速检测方法

为快速检测马铃薯晚疫病菌——致病疫霉Phytophthora infestans对甲霜灵的抗性,基于已知致病疫霉RPA190基因的T1145A变异引起的F382Y氨基酸点突变与甲霜灵抗性有关,通过设计4对特异性引物F382Y-F1/F382Y-R、F382Y-F2/F382Y-R、F382Y-F3/F382Y-R和F382Y-F4/F382Y-R建立等位基因特异性PCR(allele specific-polymerase chain reaction,AS-PCR)快速分子检测法,其中F382Y-R引物在4对引物里保持不变,并分析所建分子检测法的特异性和灵敏度。结果表明,正向特异性引物F382Y-F2、F382Y-F3和F382Y-F4的3''末端在致病疫霉抗甲霜灵菌株原有核苷酸突变位点1145A(对应引物为F382Y-F1)的基础上,再人工引入第1144位的核苷酸突变,将1144T分别突变成1144G、1144C和1144A,并优化退火温度和特异性引物与内参引物ITS1/ITS4比例,最终确定最适退火温度分别为54、60和58℃,特异性引物与内参引物最适浓度比例均为5∶1。以该3条引物对应的3对特异性引物和内参引物ITS1/ITS4组成的3组多重AS-PCR引物对甲霜灵敏感和抗性菌株具有良好的特异性,敏感菌株的扩增产物含1条879bp的内参片段,抗性菌株的扩增产物为1条879bp的内参片段和1条461bp的目的片段。3组AS-PCR检测体系均具有较高的灵敏度,其中引物F382Y-F4/F382Y-R对致病疫霉DNA的检测灵敏度达0.4pg/μL,引物F382Y-F2/F382Y-R和F382YF3/F382Y-R的检测灵敏度达4pg/μL。     

2018年湖北省小麦赤霉菌群体组成及杀菌剂敏感性检测

 由小麦赤霉菌(Fusarium spp.)引起的小麦赤霉病是小麦生产中最主要的病害之一,严重影响小麦的产量和品质。为明确目前湖北省小麦赤霉菌种群的组成、毒素化学型的分布及对杀菌剂的敏感性现状,本研究于2018年采集分离了96株小麦赤霉菌菌株,经TEF1-α基因鉴定,78株为Fusarium asiaticum,18株为F. graminearum,表明湖北省小麦赤霉菌的优势群体为F. asiaticum;利用特异性片段扩增法鉴定了菌株的毒素化学型,结果表明湖北省小麦赤霉菌菌株以3A DON化学型为主,占供试菌株群体的58%,其次为15A DON,占32%,NIV化学型最少,占10%。采用区分浓度法共检测到2株对多菌灵产生抗药性的菌株,均为F. asiaticum菌株。采用菌丝生长速率法,测定了Fusarium spp.对戊唑醇的有效抑制中浓度(EC₅₀),平均值为(0.66± 0.29)μg·mL^-1,其敏感性已经下降;其中,F. asiaticum与F. graminearum对戊唑醇的EC₅₀均值分别为(0.77± 0.26)μg·mL^-1和(0.35 ± 0.08)μg·mL^-1,表明F. graminearum群体对戊唑醇更敏感。     

瓜黑星病菌、枯萎病菌和蔓枯病菌的三重PCR检测

通过测定黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)rDNA的ITS序列,比对近缘种及瓜类几种重要病原菌的ITS序列,设计出特异性引物HX-1/HX-2,经过对引物HX-1/HX-2PCR条件的优化,可以扩增出1条190bp的黄瓜黑星病菌特异性DNA条带,灵敏度达到1pg/μL。进一步将引物HX-1/HX-2和瓜类枯萎病菌、瓜类蔓枯病菌特异检测引物Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组合,建立三重PCR体系,可一次检测出瓜类黑星病菌、瓜类枯萎病菌、瓜类蔓枯病菌3种瓜类植物重要的病原菌。建立了可以应用于田间瓜类黑星病菌PCR检测技术和瓜类主要病害三重PCR检测技术,对瓜类病害的诊断和防治具有重要的指导作用。     

大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的特异扩增

 根据棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)核糖体基因ITS区段的碱基编码序列,设计合成了1对为26 bp的PCR特异扩增引物(引物1:5'CATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACG,和引物2:3'CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA),进行了大丽轮枝病菌PCR特异扩增试验。试验结果表明:本试验设计合成的这对引物,能对大丽轮枝菌全基因组DNA和人工接种棉花黄萎病病株组织特异地扩增到大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的324 bp分子片段,该对引物可用于棉花黄萎病的分子鉴定和分子监测。本试验结果对棉花黄萎病的早期诊断和病原菌的检测和监测有潜在的应用价值。     

栎枯萎病菌与栎树疫霉猝死病菌的多重PCR检测方法

根据实验室设计的栎枯萎病菌的特异性引物CF01/CF02和2004年Hayden等设计的栎树疫霉猝死病菌特异性引物Phyto1/Phyto4,组合并优化出了可以同时检测2种病原菌的多重PCR检测体系,经PCR扩增可以分别得到687bp和280bp两条特异性条带,利用菌丝DNA检测,灵敏度为10pg基因组DNA。     

马铃薯腐烂茎线虫特异性分子检测技术研究

 本研究利用通用引物(rDNA1/rDNA2)研究了21个国内甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)群体和1个韩国马铃薯茎线虫(D.destructor)群体的rDNA-ITS序列,从21个国内群体中扩增出2个大小不同的ITS片段,分别约为940bp和1100bp;经克隆、序列测定和分析比对发现其ITS区存在特异性差异,分别命名为A型和B型,其中18个群体DdTH、DdCL、DdJN、DdMY1、DdYX1、DdZZ、DdLN,DdDX1、DdFN,DdYX2、DDSX1、DdDX2、DdXY,DdLL、DdSX2、DdLY,DdMY2和DdPY的ITS扩增产物约为940bp,称之为A型马铃薯腐烂茎线虫(940bp),3个群体DdSH,DdTS,DdYS为B型马铃薯腐烂茎线虫(1100bp)。设计构建并筛选出A型和B型马铃薯腐烂茎线虫2对特异性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2,分别扩增出A型马铃薯腐烂茎线虫、B型马铃薯腐烂茎线虫群体的特异片段252bp和485bp;引入D3A/D3B作为内标,设计出一步双重PCR检测技术;同时优化了检测体系和PCR反应程序。该技术具有较高的特异性和灵敏性,能快速、准确地检测出不同型的马铃薯腐烂茎线虫群体。     

基于Dickeya dadantii特有标志基因检测甘薯茎腐病菌

 甘薯细菌性茎腐病是由达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)引起的一种检疫性病害,近年来在我国多地发生,严重威胁我国甘薯产业的发展。建立特异灵敏的检测D. dadantii的方法对于鉴定检疫病原菌、田间监测病原菌和防控病害有重要意义。本研究对Dickeya属菌株的全基因组序列进行比较基因组学分析,筛选到D. dadantii特有的标志基因,针对标志基因设计引物,其中针对编码登录号为WP_077245517未知蛋白基因的1对引物Dad1-F(5′-CATATCAACCAGACCAGCCGTT-3′)和Dad1-R(5′-CGGCCTGCTTTTAAACAACGTATTA-3′)能只从D. dadantii扩增到167 bp目的片段。由此建立了特异灵敏的常规PCR和实时荧光定量PCR检测D. dadantii的方法,为鉴定检疫甘薯茎腐病病原菌和田间监测病害提供了有效方法。     

基于Dickeya dadantii特有标志基因检测甘薯茎腐病菌

 甘薯细菌性茎腐病是由达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)引起的一种检疫性病害,近年来在我国多地发生,严重威胁我国甘薯产业的发展。建立特异灵敏的检测D. dadantii的方法对于鉴定检疫病原菌、田间监测病原菌和防控病害有重要意义。本研究对Dickeya属菌株的全基因组序列进行比较基因组学分析,筛选到D. dadantii特有的标志基因,针对标志基因设计引物,其中针对编码登录号为WP_077245517未知蛋白基因的1对引物Dad1-F(5′-CATATCAACCAGACCAGCCGTT-3′)和Dad1-R(5′-CGGCCTGCTTTTAAACAACGTATTA-3′)能只从D. dadantii扩增到167 bp目的片段。由此建立了特异灵敏的常规PCR和实时荧光定量PCR检测D. dadantii的方法,为鉴定检疫甘薯茎腐病病原菌和田间监测病害提供了有效方法。     

京津冀设施大棚根际土壤中筛选出的防治根腐病的生防镰孢菌

 由致病性尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)引起的根腐病严重危害果蔬生产,但非致病性镰孢菌可作为潜在的生防菌。为筛选防治根腐病的非致病生防镰孢菌,从京津冀设施大棚采集茄科、葫芦科果蔬78份根际土样中分离2 402株真菌,筛选出对致病性尖孢镰孢菌(F. oxysporum)具有拮抗效果的真菌173株。利用镰孢菌通用引物进行PCR扩增,从中筛选出28株候选镰孢菌;通过镰孢菌发酵液泡根进行安全性测试,筛选出对寄主黄瓜幼苗安全无害的镰孢菌菌株4株(1418、1441、1436和1473)。进一步通过镰孢菌测序通用引物TEF1αF/TEF1αR结合菌落和分生孢子的形态学特征,1418菌株和1441菌株被鉴定为尖孢镰孢菌(F. oxysporum)、1436菌株被鉴定为茄病镰孢菌(F. solani)。盆栽测试发现,除1441菌株外,1418菌株、1436菌株和1473菌株对黄瓜根腐病的防效均在50%以上,其中1418菌株的防效为70%,与杀菌剂咪酰胺的防效相当,具有很好的应用潜力。本研究筛选获得的具有生防潜力的镰孢菌不仅为镰孢菌致病力分化的研究提供了实验材料,也为新型生防产品的研制奠定了基础。