北京地区奶牛场A2基因型纯合个体的调查

牛奶蛋白主要分为乳清蛋白和酪蛋白,其中酪蛋白的45％为β-酪蛋白,β-酪蛋白有两个主要的变异型,即A1型和A2型.为了解北京地区奶牛场A2型β-酪蛋白的分布情况,本研究采用PCR扩增牛β-酪蛋白(CSN2)部分基因片段后,用DdeⅠ对扩增产物进行酶切,建立了PCR-RFLP检测A2基因的方法.根据对北京地区155头荷斯...     

奶牛乳腺上皮细胞的二维和三维培养及培养后酪蛋白基因的表达

本试验研究了二维和三维培养对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)形态与β-酪蛋白、κ-酪蛋白、αs1-酪蛋白基因表达的影响.试验采用内蒙古地区3头5岁泌乳期健康荷斯坦奶牛的乳腺组织,将BMEC经3代培养纯化后分别进行二维和三维培养,观察不同培养模式下细胞的生长形态,测定β-酪蛋白、A-酪蛋白、αs1-酪蛋白基因的表达量.结果表明:2种培养模式下的BMEC呈现不同的细胞形态,二维培养的BMEC呈典型铺路石样细胞形态,三维培养的BMEC则形成了类腺泡的聚集物和管腔结构.利用三维培养的BMEC的αs1-酪蛋白基因的表达量显著地高于二维培养(P＜0.05),三维培养的BMEC的β-酪蛋白和κ-酪蛋白基因的表达量极显著地高于二维培养(P＜0.01).结果提示,三维培养的BMEC3种酪蛋白基因的表达量均高于二维培养,三维培养的BMEC在形态上呈现的特点与在体内更加接近.     

猪伪狂犬病病毒经典毒株与变异毒株双重实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为了建立一种快速检测猪伪狂犬病病毒(PRV)经典毒株和变异毒株的双重实时荧光定量PCR方法，试验根据GenBank上收录的30株PRV设计gE基因和gC基因的特异性引物和探针，构建含有gE基因和gC基因的标准质粒，优化扩增体系建立双重实时荧光定量PCR方法，并检验该方法的特异性、敏感性和重复性，同时绘制标准曲线，最后采用该方法对临床样品进行检测。结果表明：试验建立的双重实时荧光定量PCR方法的最佳退火温度是60℃,最佳引物体积为0.8μL,最佳探针体积为0.4μL。该方法对猪场常见疫病病原猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应，特异性强；对两种标准质粒pUC57-gE和pUC57-gC的最低检测限均为1×10¹copies/μL,gE基因和gC基因对应的标准曲线分别为y=-3.446x+41.920(R²=0.998)和y=-3.255x+39.185(R²...     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物，根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明：使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段；而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段，其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果，而常规PCR则需要20～30个细胞，所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别，同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。     

多重PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究

根据GenBank上已发表的猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）的VP2基因序列和猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）的gH基因序列，设计合成了两对特异引物，分别建立了PPV和PRV的单项PCR诊断方法，通过对扩增条件的筛选，最终成功地建立了PPV和PRV的复合PCR诊断方法，即利用一次PCR反应，可同时扩增PPV的751bp和PRV355bp的特异性片段，而扩增猪圆环病毒Ⅱ型（PCV．2）及相应的培养细胞（PK-15）核酸结果均为阴性，对PPV和PRV的最低检出量分别为100Pg和10Pg的DNA。该方法适合对PPV和PRV的联合检测和鉴别诊断。     

牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3（切除CMV启动子）,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。     

贵州地方猪品种与欧洲猪品种MUC13基因的多态性比较

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致仔猪腹泻的主要病原,MUC13基因被认为是控制仔猪ETEC易感或抗性的候选基因。本文通过等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR)方法对4个贵州地方猪种MUC13基因的多态性进行研究,并与两个欧洲猪群相比较。结果显示:贵州地方猪群中MUC13基因的G等位基因频率较高,特别是香猪和黔北黑猪群体分别达到了95.21%和96.43%,与贵州地方猪品种优良的抗腹泻表现相符。提示贵州地方猪品种MUC13基因的G119A位点可以作为抗腹泻筛选的SNP分子标记。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

不同浓度胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因表达的影响

应用Real-time PCR方法检测不同浓度(0、1、10和100 ng/mL)胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)处理后的体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和脂肪合成相关基因mRNA的相对表达量。结果表明,添加不同浓度IGF-Ⅰ对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞IGF-Ⅰ受体基因(IGFIR)、IGF-Ⅰ结合蛋白-3基因(IGFBP3)、α-s1-酪蛋白基因(CSN1S1)和κ-酪蛋白基因(CSN3)mRNA的相对表达丰度均无显著影响(P>0.05)。随着IGF-Ⅰ添加浓度的增加,β-酪蛋白基因(CSN2)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACACA)、脂肪酸合成酶基因(FASN)和脂肪酸结合蛋白-3基因(FABP3)mRNA的相对表达丰度显著上调(P<0.05)。提示,IGF-Ⅰ作为一种重要细胞因子参与调节乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪相关基因mRNA的表达。     

猪圆环病毒2型cap基因与猪γ-干扰素基因双表达载体的构建及稳定表达

通过PCR方法分别从含有猪圆环病毒2型(PCV-2)核衣壳蛋白(Cap)基因和猪,γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ的基因,将两基因亚克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,构建重组真核双表达载体pBud-IFNPCV。重组质粒转染BHK-21细胞后进行Zeocin~(TM)抗性筛选建立细胞系,阳性细胞通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测cap和PoIFN-γ在BHK-21细胞中的表达。结果显示,试验中筛选出1株Zeocin~(TM)抗性阳性BHK-21细胞,cap和PoIFN-γ均在该细胞中获得稳定高效表达,这将为猪圆环病毒病的防治提供新的方法。     

猪原始生殖嵴（PGCs）细胞分离、建系培养

从五指山近交系 (ＷＺＳＰ)培育群中 ,先后选用自然或同期发情 1 1头 5 8月龄青年母猪 ,分别于授精后 2 5～ 2 9ｄ采集胎儿 75个 ,进行原始生殖嵴 (ＰＧＣｓ)细胞分离、培养等建系技术研究。培养液为ＤＭＥＭ Ｆ1 2 ( 1∶1 ) ,并含 1 5 %胎牛血清、0 1ｍｍｏｌ/Ｌ硫基乙醇、40ｎｇ/ｍｌｈＳＣＦ、2 0ｎｇ/ｍｌｈＬＩＦ、2 0ｍｍｏｌ/Ｌ谷胱甘肽 ,另添加或不添加 2 0ｎｇ/ｍｌｂＦＧＦ作为对比试验。用ＳＴＯ细胞作饲养层 ,在 37 5℃、5 0 %ＣＯ2和湿润的气相中进行培养。分别冷冻保存胚胎生殖嵴细胞 (ＥＧ)细胞系 1 1个 ,其中 2个ＥＧ…     

猪圆环病毒2型核酸载体构建及分子免疫研究

利用PCR技术和亚克隆技术构建了猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白基因与猪a—IFN基因的真核双表达质粒pIRES—Cap—α—IFN,经酶切、PCR鉴定和测序表明构建成功。将该质粒免疫6～8周龄BALB／c纯系小鼠,每隔2周免疫1次,共免2次,每次免疫前采血分离血清,实验结束时杀鼠取脾制备T淋巴细胞。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体水平,用MTT法检测T细胞增殖情况。结果表明,pIRES-Cap—α—IFN免疫组能显著刺激T淋巴细胞增殖（P〈0．05）,促进机体产生体液免疫但差异不显著（P〉0．05）,为PCV2核酸疫苗研究奠定了较好的前期基础。     

猪群高热症的血清流行病学调查研究

采用血清学试验对贵阳市花溪区某种猪场的95份血清样本进行猪繁殖障碍性疫病血清学检测,以了解猪群免疫水平及疫病感染状况.结果显示,猪群O型口蹄疫（O-FMD）、猪瘟（HC）、猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）、猪伪狂犬病（PR）免疫合格率分别为100％ （33/33）、62.9％（39/62）、14.5％ （9/62）、61.3％ （38/62）,HC、PRRS和PR免疫合格率均未达到农业部要求;通过比较母猪免疫抗体与仔猪母源抗体水平相关性,发现HC与PR首免后抗体保护期维持较短,PRRS免疫不合格;猪群猪圆环病毒病（PC）、猪细小病毒病（PP）隐性感染抗体阳性率分别为70.5％ （67/95）、82.1％（78/95）,隐性感染情况严重.血清流行病学调查结果表明,该猪场应改进HC、PR免疫程序,立即对全群进行PRRS补免,并要高度重视PC和PP的防控。     

中药“孕宝”对子宫炎病牛肿瘤坏死因子—α含量的影响

为了探讨中药“孕宝”治疗母牛子宫炎提高受胎率的作用机理，本试验用ELISA方法测定了病牛服用中药前后血清及子宫粘液中肿瘤坏死因子－α（TNF-α）的含量（用OD值表示）。结果患子宫炎病牛子宫粘液和血清中OD值均高于健康牛。服用中药使病牛子宫粘液的OD值由0.2358±0.2821下降至0.0653±0．0267（n＝8），对照组病牛由0.2802±0.2772上升至0.3602±0.2763（n＝6）。用药组病牛血清OD值由0.6885±0.1838降至0.5328±0.1058（n＝8），而对照组无明显变化（n＝6）。这些试验表明，中药孕宝有降低子宫炎病牛炎性细胞因子TNF-α的作用。     

三种猪Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的三种猪Ⅰ型干扰素（porcine interferon,pIFN）基因序列,设计了3对特异性引物。运用RT—PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了三种猪干扰素基因,并将其克隆至pGEM-T Easy载体上。序列测定结果显示,获得的猪干扰素α1基因序列全长570bp,编码189个氨基酸,获得的猪干扰素α2基因序列全长540bp,编码179个氨基酸,获得的猪干扰素β基因序列全长563bp,编码186个氨基酸。三种猪Ⅰ型干扰素基因与已知猪Ⅰ型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99％～100％。     

2008～2010年华东部分地区猪圆环病毒2型感染血清学调查

为了解华东地区近三年来猪圆环病毒病（porcine circovirus disease,PCVD）的流行状况,以便更好地控制该病的发生,2008年1月～2010年9月在华东地区5个省、直辖市及河南省的68个规模化猪场（均未免疫商品化猪圆环病毒疫苗）共收集1017份猪血清样品,应用商品化猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）抗体诊断试剂盒（PCV2-ELISA）,对送检血清样品进行PCV2抗体水平检测。结果显示：送检猪血清中抗体阳性总数为609份,总阳性率为59.88%;2008、2009和2010年送检样品的阳性率分别为53.4%、35.33%和80.63%,PCV血清抗体阳性率呈先下降后上升的趋势;成年猪血清阳性率最高为81.40%,保育猪血清阳性率最低为41.48%,仔猪和育肥猪血清阳性率相近,分别为57.95%和52.20%,说明仔猪断奶后随母源抗体下降其抗体阳性率亦下降,但随猪龄的增长而感染逐渐加重后其抗体阳性率又升高,且不同生长阶段PCV毒抗体阳性率有明显差异。     

重组猪α干扰素冻干保护剂的筛选

为使重组猪仪干扰素（rPoIFN—α）制品更好地应用于生产实践中,采用保守的冻干工艺重点对rPoIFN-α制品的冻干保护剂进行筛选,通过外观检测、水分含量、活性检测对14种冻干保护剂进行了比较和筛选。研究结果表明,终浓度2％、4％和5％的甘露醇的保护效果较好,活性保持率分别为102．8％、95．1％、108．3％。按照活性好的这三个配方再冻干三批制品进行放置40℃加速稳定性实验。结果表明,在40℃放置三个月后,三个保护剂制品效价基本没变化,稳定性良好,有效期暂定为两年。本研究初步探索了rPoIFN一仪的冻干配方,为rPoIFN-α的产业化打下了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代毒株反向遗传系统的优化

反向遗传系统已成为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）结构与功能非常重要的手段,并且在设计基因工程疫苗中发挥不可替代的作用。因而,有效提高感染性克隆拯救病毒的效率和稳定性以及降低经济成本是一个急需解决的课题。本研究在已构建完成的高致病性PRRSV细胞传代毒株反向遗传系统（pAJXM）的基础上,做了以下三方面的工作：（1）将T7启动子换成hCMV（人类巨细胞病毒,Human cytomegalovirus）启动子,从而全长cDNA克隆不需经过体外转录成mRNA的过程,直接通过DNA转染MARC-145细胞拯救病毒;（2）研究hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间最佳的碱基数目,使体内转染获得的病毒基因组5末端序列为病毒的真实序列;（3）在病毒基因组3末端添加丁型肝炎病毒核酶（delta hepatitis virus ribozyme,HDVr）序列,体内转染获得的病毒基因组3末端的非病毒序列通过核酶自动去除。研究发现,基于DNA转染的反向操作系统是可行的,并且hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间的碱基数目设置为25和在病毒基因组3末端添加HDVr序列后,能够有效地提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和稳定性。     

猪增生性肠炎的研究进展

猪增生性肠炎（porcine proliferative enteritis,PPE）,又称猪增生性肠病（porcine roliferative nteropathy,PPE）,是以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞发生腺瘤样增生为特征的猪的一种肠道综合症。本文主要概述其痛原学、流行病学、发病机理、临床症状、病理变化、诊断以及防治等方面的研究现状。     

贵阳市规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征血清学调查研究

试验应用ELISA检测方法对贵阳市3个未免疫猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）猪场和9个免疫猪场的后备母猪、生产母猪和5～10周龄断奶仔猪3个猪群进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测。结果表明：贵阳市3个未免疫猪场中2个有PRRSV感染,猪群抗体阳性率在0％-10％之间,平均阳性率为5％;9个免疫猪场猪群PRRSV抗体阳性率在65％～90％之间,平均阳性率为82．80％,未免疫猪场与免疫猪场猪群抗体平均阳性率相比,差异极显著（P〈0．01）。