尼帕病毒G和F蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗尼帕病毒(NiV)G和F蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以表达NiV G和F蛋白的真核重组表达质粒pCAGG-NiVG和pCAGG-NiVF分别免疫BALB/c小鼠,采用常规技术制备杂交瘤细胞;以表达G和F蛋白的重组牛痘病毒(rWR-NiVG、rWR-NiVF)分别感染BHK细胞,通过间接免疫荧光(IFA)筛...     

用DNA免疫研制鸡白细胞介素2单克隆抗体

构建鸡白细胞介素2(鸡IL-2)的真核重组质粒pcDNA-IL-2和原核重组质粒pET-IL-2,以重组质粒pcDNA-IL-2免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以重组质粒pET-IL-2在大肠杆菌BL21(DE_3)中诱导表达的蛋白作为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后共获得3株针对鸡IL-2的特异性单克隆抗体,并对这3株单克隆抗体的特性进行了鉴定。     

裂谷热病毒eGn蛋白的制备及免疫原性验证

通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrap~(TM)FF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。     

牛朊蛋白和酵母朊毒体结构域融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将酵母Ure2p朊蛋白结构域(UPD)基因插入牛朊蛋白(BPrP)表达质粒pET-PrP中,构建原核表达载体pET-PrP-UPD.阳性质粒转化宿主菌BL21 (DE3),在IPTG诱导下获得高效表达.Westernblot检测表明表达的重组蛋白与单克隆抗体6H4呈现特异性反应,且纯化的PrP-UPD融合蛋白在体外具有聚集成淀粉样纤维、抵抗蛋白酶K消化等朊毒体的结构特点.利用纯化的PrP-UPD免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经克隆和筛选,获得3株稳定分泌抗重组PrP单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G3、3A4、4D1,其中1G3分泌的单抗能识别细胞型牛朊蛋白,其Ig亚类为IgG2b,腹水ELISA效价为1×105,Western blot表明该单抗具有较强的特异性.     

安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及原核表达

为克隆和原核表达安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)的部分编码基因(AB),本研究根据COWP基因序列设计引物,RT-PCR扩增目的基因AB,从而构建重组原核表达质粒pET-AB。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE以及western blot鉴定。回收并纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫和体液免疫水平。SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白约为16 ku,可以被HRP标记的抗组氨酸抗体和安氏隐孢子虫免疫的小鼠血清识别。经重组蛋白免疫的BALB/c小鼠抗体水平以及CD4+和CD8+的值均差异显著(p0.05),表明获得的重组蛋白具有一定的免疫原性。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的研制

为研制鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV) VP1蛋白单克隆抗体,用已鉴定的Ⅰ型DHV的全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,并以构建的原核重组质粒pET-VP-1在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的VP1蛋白作为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后获得l株针对Ⅰ型DHV VP1蛋白的特异性单克隆抗体.对该株单克隆抗体的特性鉴定发现其特异性强、中和性较好.该抗体为今后Ⅰ型鸭肝炎病毒的检测试剂盒研制提供了重要的生物制剂.     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

本研究旨在采用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的核衣壳蛋白(N),并进一步制备其单克隆抗体。将构建重组原核表达质粒pET28a-N转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白,并采用Ni-NTA亲和层析和分子筛进行纯化。将纯化后的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并对其分泌抗体的特性进行了分析。结果显示:重组质粒pET28a-N在E.coli BL21中高效表达,筛选获得了2株稳定分泌抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A3和4F6,其分泌的抗体均为IgG1亚型,腹水效价分别为5.12×10~5、1.28×10~5。本研究为进一步研究N蛋白的功能以及建立PEDV免疫学诊断方法奠定了基础。     

一株抗猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备抗猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达系统表达的重组VP2蛋白(r VP2),纯化后将其免疫BALB/c小鼠,取免疫的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出一株稳定分泌抗VP2 MAb(1D3)。通过间接免疫荧光试验和western blot对该MAb的免疫活性和特异性进行鉴定,结果表明1D3 MAb仅能够特异性与EMCV全病毒反应。此外,通过构建截短的VP2蛋白重组质粒,采用western blot的方法对VP2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 1D3识别的线性表位区域为89DGGVFGAALRRH100。本实验结果为进一步研究VP2蛋白的功能及建立EMCV检测方法奠定了基础。     

IBDV血清Ⅱ型VP5蛋白原核表达及型特异性单克隆抗体的制备

本实验构建表达了传染性法氏囊病病毒(IBDV)血清Ⅱ型23/82株VP5蛋白,并制备出能够区分不同血清型IBDV的单克隆抗体(mAb).利用EcoR I和Xho I双酶切pUC57-23/82VP5质粒,获得23/82株IBDV VP5基因片段,连接到同样处理的原核表达质粒pET-28a,经酶切鉴定获得重组质粒pET-23/82VP5,转化到宿主茵BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白,SDS-PAGE分析表明该融合蛋白分子量大小约为23 ku.Ni-NTA柱纯化重组蛋白,复性后免疫8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,常规方法进行细胞融合,获得1株阳性杂交瘤细胞株(5D3),IFA和western blot分析表明该细胞株分泌的mAb仅与血清II型IBDV 23/82株VP5反应,不与血清I型IBDV Gt株VP5反应.腹水抗体间接ELISA效价为1×104.该mAb的制备为研究血清II型IBDV的VP5的功能和标记疫苗的研制奠定了基础.     

山羊痘病毒p32基因的克隆、表达及单克隆抗体制备

本研究旨在表达山羊痘病毒p32蛋白、制备p32蛋白单克隆抗体。通过PCR克隆p32基因,连接到pMD18-T并测序;酶切、连接后将p32基因克隆到pET28a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,在IPTG诱导下成功表达p32蛋白;利用亲和层析法纯化p32蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后制备p32蛋白单克隆抗体,获得22株识别重组蛋白的单抗,通过间接免疫荧光鉴定,其中3株能识别病毒的p32蛋白。山羊痘病毒p32蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。     

猪α干扰素与白介素-18融合基因的克隆、原核表达及其抗病毒活性的初步研究

为探索猪α干扰素（poIFN-α）与白介素-18（poIL-18）融合基因的抗病毒效果,本研究通过融合PCR,以质粒pMD18-T/poIFN-α和pMD18-T/poIL-18为模板扩增猪IFNα-IL18（poIFNα-IL18）融合基因。将poIFNα-IL18融合基因插入原核表达载体pET-28b（+）构建重组表达质粒pET-28b/poIFNα-IL18,转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;经镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化后,用微量细胞病变抑制法在PK-15/VSV系统上进行抗病毒活性测定。结果表明成功构建重组表达质粒pET-28b/poIFNα-IL18;SDS-PAGE可检测到分子质量为37 ku左右的蛋白条带,与目的蛋白大小相近;经镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;用微量细胞病变抑制法在PK-15/VSV系统上检测到重组蛋白poIFNα-IL18比单一蛋白poIFN-α和poIL-18的抗病毒活性显著,其抗水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV)活性分别为1.03×10⁵、1.28×10⁴及0.11×10⁴ U/mg。     

小尾寒羊β2微球蛋白的表达及其二级结构预测分析

为研究小尾寒羊绵羊白细胞抗原Ⅰ（Ovis aries leukocyte antigen classⅠ,OLAⅠ）轻链四聚体前体链β₂微球蛋白（β₂-microglobulin,β₂m）的结构和功能,根据GenBank中公布的绵羊β₂m基因设计特异性引物,提取小尾寒羊全血中的RNA并运用RT-PCR方法扩增绵羊β₂m基因,将扩增的绵羊β₂m基因克隆到pMD18-T载体,筛选出阳性克隆菌pMD18T-OLAⅠ-β₂m,经双酶切后与表达载体pET-28a（+）连接,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中构建pET-28a（+）-OLAⅠ-β₂m重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况;运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β₂m蛋白的二级结构。PCR扩增结果显示,目的基因大小为357 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆到pMD18-T载体,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株pMD18-T-OLAⅠ-β₂m,插入的目的片段大小为357 bp。阳性克隆菌株与表达载体pET-28a（+）经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后连接,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后获得pET-28a（+）-OLAⅠ-β₂m重组表达菌,经IPTG诱导表达,Western blotting检测目的蛋白大小为17.3 ku,目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,经洗涤、变性、纯化、初步获得SDS-PAGE纯化的OLAⅠ-β₂m蛋白;PORTER在线软件预测OLAⅠ-β₂m蛋白的二级结构元件α-螺旋（Hh）、β-折叠（Ee）和无规则卷曲（Cc）分别占22.03%、22.03%和55.93%。本研究成功构建了小尾寒羊β₂m基因的pET-28a（+）重组表达体系,运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β₂m的二级结构,为下一步绵羊OLAⅠ类分子四聚体的构建奠定基础。     

猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6 cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni^2 金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26．5％,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。     

鸭干扰素刺激基因的克隆、表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。     

Molecular Cloning and Expression of Duck IFIT5 Gene and Preparation of Its Polyclonal Antibodies

The aim of this study was to clone the duck interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 5(IFIT5) gene,express duck IFIT5 protein and prepare the polyclonal antibodies against the duck IFIT5 protein.Primers specific for duck IFIT5 gene were designed according to Mallard duck reference sequence(accession No.:KF956064)available in GenBank.The complete ORF of duck IFIT5 gene was amplified by PCR.Recombinant prokaryotic expression plasmids pET-30a-IFIT5,pET-32a-IFIT5 and eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-IFIT5 were constructed.Recombinant duck IFIT5 proteins were expressed and analyzed by SDS-PAGE.Recombinant duck IFIT5 proteins were purified by Ni-NTA column affinity chromatography.Rabbit anti-duck IFIT5 polyclonal antibodies were prepared from rabbits which had immunized by recombinant protein pET-30a-IFIT5.The titer of polyclonal antibodies was detected by indirect ELISA,and the specificity was identified by Western blotting.Eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1-IFIT5 was transfected into BHK21 cells and the reactivity of polyclonal antibodies was verified by indirect immunoinfluscence assay.The results showed that recombinant duck IFIT5 proteins were expressed in the form of inclusion bodies.The titer of polyclonal antibodies was approximately up to 1:49 600.Rabbit anti-duck IFIT5 polyclonal antibodies could identify recombinant protein pET-32a-IFIT5.Indirect immunofluorescence assay (IFA) confirmed that the purified polyclonal antibodies could identify duck IFIT5 protein by eukaryotic expression system specifically.These results demonstrated that the duck interferon stimulating gene IFIT5 was cloned successfully,rabbit anti-duck IFIT5 polyclonal antibodies could be used in the detection of duck IFIT5 protein,and also provided material support for the further study of duck IFIT5 protein.     

鸡毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子的克隆、表达与虫体内定位

顶复门原虫的AP2结构域蛋白(ApiAP2)可能是调控虫体生长发育的转录因子。本研究旨在克隆、表达毒害艾美耳球虫ApiAP2转录因子，检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫第3代裂殖子的总RNA为模板，RT-PCR扩增毒害艾美耳球虫EnApiAP2基因后，连接至pMD18-T载体，测序后构建pET28a (+)-EnApiAP2表达载体，转化至表达菌BL21(DE3)，重组菌经测序鉴定后诱导表达，并纯化复性重组蛋白。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗rEnApiAP2多克隆抗体。利用多克隆抗体，分别用Western blot和间接免疫荧光试验检测裂殖子中天然EnApiAP2蛋白及其定位。最后，应用荧光定量PCR分析EnApiAP2基因在第2、3代裂殖子中的转录水平。结果显示，该基因全长1 830 bp，编码610个氨基酸，含有一个AP2结构域，预测分子质量67.69 ku；重组蛋白大小约为74 ku，主要以包涵体形式存在，可以被6×HIS标签单抗、鸡抗毒害艾美耳球虫康复血清和鸡抗柔嫩艾美耳球虫康复血清识别；在第3代裂殖子中检测到天然EnApiAP2蛋白，分子质量约为85 ku；EnApiAP2蛋白定位在第2、3代裂殖子细胞核内；第3代裂殖子EnApiAP2转录水平显著高于第2代裂殖子(P<0.01)。成功克隆、表达了EnApiAP2基因，证实该基因表达的蛋白定位在裂殖子的细胞核内，为进一步研究EnApiAP2蛋白的转录因子功能奠定了基础。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫原性分析

根据空肠弯曲菌基因序列设计引物,以菌株ATCC 29428为模板扩增出peb1A基因片段,定向克隆至pMD18-T载体中,并对克隆片段测序,比较所测序列与不同来源弯曲菌的同源性;用软件改造并合成peb1A基因78 bp～780 bp区间片段,PCR扩增后,构建出表达载体pET-28a(+)-peb 1Ag,转化至E.c...     

猪戊型肝炎病毒Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)Ⅳ型衣壳蛋白单克隆抗体,将猪HEV衣壳蛋白的C端267(408—675)个氨基酸基因序列克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET-28a-ORF2-C,转化E.coli Rosetta(BL21)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后免疫小鼠。取免疫小鼠的脾脏与鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合制备单克隆抗体。通过间接ELISA和竞争ELISA方法筛选并鉴定单抗。结果表明蛋白得到正确、高效表达,获得3株识别不同的抗原表位区的单克隆抗体,分别命名为Mab-1E4(IgG1)、Mab-2C7(IgG1)和Mab-2G9(IgG2b),其中1E4和2G9能阻断临床阳性猪血清,提示该2株单克隆抗体识别的抗原表位是猪HEVⅣ型衣壳蛋白上重要的抗原表位区,而单抗Mab-2C7不能阻断。本研究为猪HEVⅣ型的诊断及研究提供重要工具。     

H3N2亚型犬流感病毒HA1基因的原核表达及抗原性分析

为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。     

山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达

以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。