堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶基因的克隆与表达

克隆了堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因(EaLDH),并在大肠杆菌中成功表达出重组蛋白.根据GenBank中收录的EaLDH核苷酸序列设计特异性引物,以其第一代裂殖体总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得EaLDH基因.将EaLDH基因片段与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组表达质粒pET28a(+)-LDH,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.结果表明,扩增出的EaLDH基因含993 bP的开放阅读框,与GenBank中收录的EaLDH基因序列相似性为98%.诱导后,重组蛋白能够在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白相对分子质量约为4.1×104.     

5株堆型艾美耳球虫顶质体rpoB基因的扩增及序列分析

以5株堆型艾美耳球虫为研究对象,对其顶质体rpoB基因的部分序列进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上发表的柔嫩艾美耳球虫及其他顶复门寄生虫相关序列进行比较,研究顶质体的遗传变异情况。结果表明,从堆型艾美耳球虫不同来源虫株均获得了469bp的目的片段,应用DNAStar软件进行序列对比发现,5株堆型艾美耳球虫的顶质体rpoB序列完全一致,与柔嫩艾美耳球虫相应序列的相似性为92.75%,而与刚地弓形虫和疟原虫的相似性分别为67.23%和64.62%。首次报道了堆型艾美耳球虫rpoB序列,显示rpoB基因序列保守,不同来源堆型艾美耳球虫虫株的序列没有差异,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫YZ株SO7基因的克隆与序列分析

对柔嫩艾美耳球虫(E im eria tenella)YZ株折光体SO 7基因进行克隆,并对其核苷酸及氨基酸进行序列分析。以纯化的发育7 h的E.tenella YZ株卵囊孢子提取的总RNA为模板,设计特异性引物,应用两步法RT-PCR技术扩增出SO 7基因特异性片段。将扩增出的片段插入pUCm-T载体,随机选择经蓝白斑筛选、PCR及酶切鉴定为阳性的两个克隆分别进行测序分析,并对结果进行验证。结果表明:两个阳性克隆所含插入片段的DNA序列完全一致,含全长为651个核苷酸的开放阅读框,富含AGC和CTG重复序列,编码区核苷酸与LS18株和B J株的同源性都为99.5%,与HB株同源性为99.4%,与GD株同源性为99.7%。其推测的氨基酸序列与LS18株和GD株的同源性都为99.1%,与B J和HB株同源性为98.6%。通过对其蛋白抗原性、表面可能性、亲水性、柔性区、二级结构等参数预测表明,YZ株核苷酸的变异未引起其蛋白主要特性和B细胞表位的变化。该结果为研制E.tenella的基因工程疫苗奠定了基础。     

低温诱导堆型艾美耳球虫3-1E基因的可溶性表达

设计合成特异引物应用RT-PCR技术扩增堆型艾美耳球虫的3-1E基因。通过EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,基因连接到表达载体PET28a上,转化入Escherichia coli BL21(DE3)感受态细菌,挑取阳性菌落。经过双酶切和测序鉴定,证明含目的基因的表达载体PET28a构建成功。低温(16℃)诱导表达,经过SDS-PAGE和We-stren Bolt鉴定,表明此蛋白以可溶蛋白在细菌内表达。在诱导50h,IPTG浓度为0.4mmol/L时目的蛋白表达量最大。     

鸡堆型艾美耳球虫生物学方法鉴定

[目的]确定单卵囊分离获得的鸡球虫种类.[方法]采用生物学方法,测定该鸡球虫寄生部位、最短孢子化时间、潜伏期、孢子化卵囊和孢子囊大小等生物学特征.[结果]该鸡球虫主要寄生于十二指肠,卵囊呈卵圆形,囊壁光滑分为2层,囊内有1～3个折光性颗粒,未见卵囊残体;测100个孢子化卵囊大小为(13 ～22) μm×(11 ～ 16) μm,平均为16.96 μm×12.96 μm,形状指数1.31;测60个孢子囊大小为(8～ 13) μm×(5～8) μm,平均11.22 μm ×6.83 μm;最短孢子化时间为17 h,潜伏期为99 h.[结论]根据该鸡球虫的生物学特征及参考国内外文献,鉴定该鸡球虫为堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina).     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的细胞培养研究

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子在鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞中不能继续发育,在鸡胚小肠上皮细胞和雏鸡肾细胞中可发育到卵囊阶段。     

堆型艾美耳球虫纯种的分离鉴定和致病性观察

采用单卵囊分离技术,从长春市某鸡场鸡球虫混合种中获得1株纯种球虫,鉴定为堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina).鉴定指标寄生于十二指肠和小肠前段,卵囊为卵圆形、卵囊中型.测200个卵囊的大小为(13.5-21)×(11-17.5)μm,平均为17.5×14.5μm,形态指数为1.21.测200个孢子囊大小为(4.6-9.5)×(3.5-6.5)μm.有斯氏体,无内外残体.最短孢子化时间为18h,潜伏期97h.用此卵囊对50只2周龄的海兰公鸡分为一个不感染组和4个感染组,每只口服感染1万、2万、5万和10万个孢子卵囊.结果所有感染组与对照组的平均增重差异均为显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01).     

堆型艾美耳球虫感染对鸡若干血液理化指标的影响

以120只28日龄健康的罗曼蛋公雏为研究对象,研究堆型艾美耳球虫对感染鸡部分血液生理生化指标的影响.结果表明,感染后红细胞数量.血红蛋白、血钙、血钠、血镁、血糖、胆固醇、血清总蛋白的含量及血清SOD、GSH-Px和CAT的活性降低,其中红细胞数在第6、8天显著下降(P<0.05);血红蛋白在第4、8天显著下降(P<0.05);血钙在第8天显著下降(P<0.05);血镁和血清总蛋白在第8、10天显著下降(P<0.05);SOD活性在第2、4天显著降低(P<0.05).血钾略升高,但与对照组相比差异不显著(P>0.05).血清碱性磷酸酶先降低后又升高,最后恢复至对照组水平.     

巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过Em IMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备,为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先,从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA,反转录合成c DNA,PCR扩增Em IMP1基因片段.其次,将Em IMP1基因扩增片段连接到原核表达载体p ET-28a构建表达质粒p ET-28a-Em IMP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达;将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内,每隔2周免疫一次,一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后,用所获得的多克隆抗体,对纯化后的Em IMP1进行免疫印迹试验鉴定,用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明,克隆出的Em IMP1基因的全长为1 140 bp,诱导出的蛋白大小为70 ku,且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示,用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性,酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价.因此,可通过原核表达蛋白Em IMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株细胞培养卵囊最佳收获时间的测定

堆型艾美耳球虫早熟减毒株在鸡胚小肠上皮细胞上培育,卵囊最佳收获时间为120小时。     

柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）BJ株SO7基因的克隆和序列分析

对柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）BJ株SO7基因进行了克隆和测序分析。以纯化的E.tenella BJ 株7h孢子化卵囊的总RNA为模板,应用RNA反转录酶（M-MLV）合成Cdna,再用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增出BJ株SO7基因。用常规基因克隆方法把BJ株SO7基因插入Pgem-T克隆载体,选取正方向插入子的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明：该序列全长862个核苷酸,有一个开放性读框（65～713nt）,可编码216个氨基酸（22.4ku）。SO7-BJ与国外株SO7比较,同源性为99%,突变的8个核苷酸中,4个为有义突变。开放性读框中仅有2个核苷酸突变,其中1个为有义突变,使推测氨基酸Cly变为Cys。     

柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析

根据柔嫩艾美耳球虫子孢子微线蛋白2的cDNA序列,利用计算机设计l对引物,以柔嫩艾美耳球虫杂交株子孢子总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出1个片段。把这个片段克隆到pMD18-T载体,经酶切鉴定得到1个阳性克隆,测序及序列分析结果表明该片段为MIC2基因,开发阅读框（0RF）与E．tenella豪顿株MIC2核苷酸同源性为99.51％,推导的氨基酸序列同源性为99.12％,说明MIC2基因高度保守。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子单链抗体的构建及表达

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子抗原的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,通过在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至表达载体pET28a( )载体中进行表达,用Ni-NTA的金属亲和层析法进行纯化,通过SDS-PAGE和ELISA测定其纯度和生物学活性.电泳结果分析表明重组蛋白的相对分子量为32kDa,纯度为94%;ELISA反应结果证明该单链抗体保持了单克隆抗体的生物学特性,并能与堆型艾美耳球虫子孢子抗原发生特异性反应.     

柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)BJ株SO7基因的克隆和序列分析

对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)BJ 株 SO7基因进行了克隆和测序分析。以纯化的 E.tenella BJ 株7h 孢子化卵囊的总 RNA 为模板,应用 RNA 反转录酶(M-MLV)合成 cDNA,再用 Taq DNA 聚合酶进行PCR 扩增出 BJ 株 SO7基因.用常规基因克隆方法把 BJ 株 SO7基因插入 pGEM-T 克隆载体,选取正方向插入子的一个阳性克隆进行酶切分析及插入片段的全序列测序分析。结果表明:该序列全长862个核苷酸,有一个开放性读框(65～713nt),可编码216个氨基酸(22.4kD)。SO7-BJ 与国外株 SO7比较,同源性为99%,突变的8个核苷酸中,4个为有义突变.开放性读框中有仅2个核苷酸突变,其中1个为有义突变,使推测氨基酸 Cly 变为 Cys。     

鸡堆型艾美尔球虫3-1E抗原表位的生物信息学预测

应用生物信息学分析和预测鸡堆型艾美尔球虫3-1E蛋白二级结构和抗原表位,为确定和筛选优势表位,研制安全、高效表位疫苗奠定基础。以克隆获得的鸡堆型艾美尔球虫3-1E蛋白氨基酸一级结构为基础,采用DNAStar软件和生物信息学在线分析程序Prot Param、SOSUI、IEDB、SYFPEITHI等预测3-1E蛋白理化性质和二级结构,并分析其序列跨膜区、可溶性、亲水性、可及性、柔韧性参数以及抗原指数,预测B细胞表位和T细胞表位的可能区域。3-1E蛋白由170个氨基酸组成,分子式C818H1257N213O272S3,分子质量18.5234 ku,理论等电点为4.25,半衰期为10 h;无跨膜区均为膜外区,是一种可溶性蛋白。其二级结构中α螺旋占31.76%,β转角为12.35%。B细胞表位预测区域:44-49、65-67、86-87、111-116;分值较高的T细胞表位区域:52-60、94-102、97-105、154-162、157-165。运用生物信息学方法确定3-1E存在多个抗原表位,对进一步研究3-1E的抗原性和研发优势表位疫苗具有重要意义。     

堆型艾美耳球虫子孢子纯化

笔者通过比较不同成分脱囊液的子孢子脱囊效果和不同蔗糖密度梯度分离纯化堆型艾美耳球虫子孢子的纯化效果来探索较佳的分离纯化堆型艾美耳球虫子孢子的条件。通过试验证明10%鸡胆汁+0.75%(W/V)胰酶脱囊效果最好。75%(W/V)和20%(W/V)蔗糖密度梯度离心得到的子孢子回收率最高,且纯度最好,染色证明纯化后的堆型艾美耳球虫子孢子仍具有较高的活性。     

堆型艾美耳球虫早熟株和母株对8种抗球虫药的敏感试验

[目的]探讨堆型艾美耳球虫早熟株和母株对常用抗球虫药的敏感性。[方法]选用地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星、盐霉素和拉沙洛西8种抗球虫药,进行鸡体试验,通过抗球虫活性百分比（POAA）、病变记分减少率（RLS）、相对卵囊产量（ROP）和抗球虫指数（ACI）4项指标进行综合评定。[结果]堆型艾美耳球虫早熟株和母株均对地克珠利、氯苯胍、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、马杜米星和拉沙洛西敏感,对盐霉素轻度敏感,对二硝托胺不敏感。[结论]遗传背景相同的虫株,其药物敏感性也相同。     

牛分支杆菌ESAT-6基因的克隆与序列分析

从患结核病鹿的肺组织中粗分离牛分支杆菌制备DNA模板,用PCR对牛分支杆菌ESAT-6基因进行了扩增,将扩增的产物连接于测序载体pGEM-TE上克隆,经测序确定无误;并使用分子生物学软件对ESAT-6基因进行了分析。结果显示:ESAT-6基因编码的蛋白有较好的抗原性;ESAT-6基因在结核分支杆菌和牛分支杆菌各基因型中具有高度保守性。本研究为下—步研制重组标记疫苗奠定了基础。